Получение ДНК-фрагментов желаемого размера

Страница 1

ДНК, подвергаемая частичному гидролизу, должна быть достаточно высокомолекулярной. Методика приготовления образцов ДНК та же, что и для пульс-электрофореза, с той лишь разницей, что количество ДНК рассчитывается для препаративных целей.

1. Исходя из того, что одна клетка млекопитающего содержит 6,7 пкг ДНК, необходимо вырастить их столько, чтобы получить достаточное количество ДНК. Обычно для создания библиотеки требуется 200 мкг ДНК, что соответствует приблизительно 3х107 клеткам. ДНК должна быть очень высокого качества, поэтому очень важно растить клетки в оптимальных условиях. Можно приготовить клетки и из периферической крови центрифугированием в смеси Ficoll-Hypaque.

2. После сбора клеток аккуратно просчитайте их количество в гемоцитометре и суспендируйте в таком объеме фосфатно-солевого буфера, чтобы концентрация клеток составляла примерно 2хЮ7/мл. Затем суспензию быстро смешайте с равным объемом расплавленной 2%-ной низкоплавкой агарозы в 125 мМ ЭДТА при 40°С. Залейте в форму. Кроме стандартных ячеек форма должна иметь ячейки для блоков размером 2x8x135 мм, которые служат для получения ДНК в препаративных количествах. Полезно приготовить 10–20 стандартных блоков с ДНК для тест-гидролизатов и два больших блока непосредственно для опытов.

3. Обработайте ДНК протеиназой К в присутствии больших количеств ЭДТА и N-лаурилсаркозина, как описано ранее.

4. Очищенную ДНК проверьте на нативность и на присутствие нуклеаз. Для этого инкубируйте половину содержимого блока при 37°С 3 ч с 10 мм MgCl2 и нанесите эту смесь, а также необработанную половину на OFAGE-гель или на гель для электрофореза в инвертированном поле. Определите размер ДНК. Необработанная ДНК должна практически полностью остаться в лунке, а в обработанном магнием препарате не должно быть низкомолекулярных примесей. Только в этом случае можно использовать препараты для «прыжков по хромосоме». Если же в препаратах, обработанных магнием, налицо признаки деградации, значит они загрязнены нуклеазами и надо повторить обработку протеиназой К. Как правило, этого бывает достаточно, чтобы избавиться от загрязнений.

5. Из некоторых источников ДНК постоянно выделяется с небольшим количеством низкомолекулярных примесей размером 50–100 т. п.н., видимо из мертвых клеток. Наиболее характерно это для лимфобластов. Такие деградировавшие молекулы ДНК могут сильно искажать результаты «прыжков по хромосоме», поэтому необходимо удалить их из агарозных блоков перед обработкой рестриктазами. Для этого блоки помещают в лунки OFAGE-геля и проводят пульс-электрофорез в течение 2–3 ч с интервалами между импульсами 20 с. Молекулы ДНК размером менее 100 т. п.н. выходят из блоков в гель, а высокомолекулярная ДНК остается практически без изменения. Блоки затем можно изъять из геля, получив, таким образом, высококачественный материал для дальнейшего исследования.

6. Проведите контрольную рестрикцию половинок агарозных блоков различными концентрациями Mbol. Согласно данной методике, в каждой половине блока содержится примерно 3,3 мкг ДНК, следовательно, концентрация фермента составит от 0,01 ед./мкг до 0,045 ед./мкг. Остановите реакцию добавлением 10 мкл ЭДТА. Обработанные рестриктазой образцы поместите в гель и проведите пульс-электрофорез. Это поможет определить концентрацию фермента, оптимальную для получения фрагментов нужного размера. На рисунке наглядно продемонстрирована необходимость пре-электрофореза для удаления низкомолекулярных примесей ДНК перед обработкой рестриктазами.

7. При использовании больших агарозных блоков пропорционально увеличьте количество фермента, но так, чтобы концентрации фермента в ед./мкл и ДНК в мкг/мл остались прежними.

8. Обработанные рестриктазой препаративные блоки поместите в гель и, используя соответствующие маркеры, проведите пульс-электрофорез с интервалами между импульсами, позволяющими хорошо отделить фрагменты нужной величины.

Если используется OFAGE-гель, маркеры следует наносить в середине и по обоим краям геля. Мы обнаружили, что для получения прямых полос молекул ДНК желаемых размеров лучше использовать CHEF-гели и гель-электрофорез в инвертированном поле.

Популярные статьи:

Географическая оболочка земли. Понятие зональных, континентальных и океанических комплексов
«Географические процессы являются продолжением космической эволюции при образовании галактик, звездных и планетных систем». Они связаны с химическими реакциями и многими другими явлениями. В результате воздействия внутренних и внешних физ ...

Хозяйственное значение
Количество перепелов, прилетающих к нам весной, заметно меняется по годам, что видимо, связано с гибелью птиц от неблагоприятных погодных условий во время весенней и осенней миграций и с различной интенсивностью охоты на путях пролёта. Сн ...

Эволюция биосферы. Учение В.И. Вернадского о биосфере
По современным представлениям, биосфера – это особая оболочка Земли, содержащая всю совокупность живых организмов и ту часть вещества планеты, которая находится в непрерывном обмене с этим организмами. Эти представления базируются на уч ...