Анализ клонов

После очистки бляшек можно приготовить минилизат ДНК из клонов, руководствуясь любой стандартной методикой. Использование на этой стадии в качестве газона LE392 позволяет получить несколько больший выход фаговой ДНК, чем при посеве на МС1061. Обработка рестриктазой ЈcoRI позволит определить размер инсерционного фрагмента. Если в данном клоне имеется более одного fcoRI-фрагмента, это значит, что при клонировании в один вектор были лигированы две вставки. В таком случае следует провести блот-гибридизацию данного клона с исходным зондом и с supF, чтобы определить, находятся ли эти вставки в одном EcoRI-фрагменте или в разных. В первом случае с клоном можно продолжать работать дальше традиционными методами; во втором случае он не представляет ценности для дальнейших исследований.

ZTcoRI-фрагмент полезно переклонировать в плазмиду, чтобы упростить работу по его изучению. Субклоны можно легко идентифицировать, благодаря наличию SHpF-маркера. Рестрицированный минилизат ДНК можно лигировать в pBR322, предварительно обработанную ЈcoRI и фосфатазой, и полученной рекомбинантной ДНК трансформировать штамм бактерии-хозяина, несущий какую-либо амбермутацию в lacZ, например CARD-15. Высев культуры на агар Мак-Конки с ампициллином позволяет практически сразу выявить интересующие колонии, так как они способны сбраживать лактозу и окрашены в пурпурный цвет в отличие от остальных, шмеющих розовую окраску.

Для того чтобы разделить стартовую и конечную точки прыжка, очень полезно использовать присутствие сайта в центре гена supF. Особенно эффективно это в том случае, когда имеющийся в pBR322 сайт Aval элиминирован. Мы добивались этого, проводя последовательно обработку плазмиды рестриктазой Aval, достраивание фрагментом Клёнова и повторное лигирование. Отделить половины клонированного фрагмента можно, обрабатывая субклоны EcoRl, Aval и обеими рестриктазами одновременно. Лиасайты встречаются иногда в геномных последовательностях, что несколько затрудняет составление карты. Однако при помощи блот-гибридизации рестрицированных субклонов с исходным зондом, supF и геномной ДНК человека, позволяющей локализовать повторы, обычно легко удается построить рестрикционную карту и идентифицировать уникальные последовательности. А это, в свою очередь, позволяет определить, является ли данный прыжок эффективным. Результаты блот-гибридизации представляют особый интерес, так как с их помощью удается идентифицировать ближайшие к супрессорному гену фрагменты.

В случае же использования supF с дополнительными вставками редко встречающихся сайтов рестрикции разделение половинок фрагмента, составляющего прыжок, упрощается, и зонды можно получать непосредственно из минилизатафаговой ДНК. После того как установлено, что фрагмент – «прыжок» представлен в геноме единичной копией, надо провести его гибридизацию с блотом геномной ДНК из гибридных соматических клеток, чтобы убедиться, что прыжок осуществлен в пределах нужной хромосомы. Это очень важный момент, так как при создании геномной библиотеки всегда существует опасность нециклического лигирования.

Популярные статьи:

Особенности маслянокислого брожения. Механизм маслянокислого брожения
Маслянокислое брожение представляет собой вариант решения донор - акцепторной проблемы на базе гликолитически образованного пирувата. Новое в маслянокислом брожении - возникновение реакций конденсации типа С2+С2 → С4, в результате ч ...

Требования к уроку с позиций здоровьесбережения
1. Обстановка и гигиенические условия в классе (кабинете): температура и свежесть воздуха, рациональность освещения класса и доски, наличие/отсутствие монотонных, неприятных звуковых раздражителей и т.д. 2. Количество видов учебной деяте ...

ДНК-микрочипы
ДНК–чипы представляют собой уникальный аналитический инструмент, позволяющий определять наличие в анализируемом образце (как правило, биологического происхождения) заданных последовательностей ДНК (т.н. гибридизационный анализ). Проведени ...