Выделение тайтина из скелетных мышц

Тайтин из скелетных мышц кролика выделяли по методу (Soteriou et al., 1993) с модификациями. Мышцы гомогенизировали в 3-х кратном (по отношению к массе мышц) объеме раствора, содержащего 50 мМ KCl, 5 мM ЭГТА, 1 мM NaHCO3,, 1 мM ДТТ, 0.1 мM NaN3, pH 7.0. Для уменьшения деградации тайтина в процессе выделения в раствор добавляли набор ингибиторов протеаз: 1 мM PMSF, 20 мкг/мл ингибитора трипсина, 10 мкг/мл леупептина.

Полученный мышечный гомогенат центрифугировали в течение 5–10 минут при 2500 g. Супернатант отбрасывали, а процедуру промывки повторяли 5–6 раз. К промытому осадку добавляли 2-х кратный объем экстрагирующего раствора, содержащего 0.9 М KCl, 2 мM MgCl2, 2 мM ЭГТА, 0.5 мM ДТТ, 0.1 мM NaN3, 1 мM PMSF, 10 мM имидазола-HCl, pH 7.0. Раствор также содержал 40 мкг/мл соевого ингибитора трипсина и 20 мкг/мл леупептина.

Экстракция проводилась на льду при 4˚С в течение 10–15 минут при непрерывном перемешивании. Экстракт осветляли в течение 40 минут при 14000 g и супернатант разбавляли в 3 раза охлажденной бидистиллированной водой, содержащей 0.1 мM ДТТ и 0.1 мM NaN3, для преципитации актомиозина (конечная ионная сила ~0.2). Через 1 час супернатант осветляли в течение 60 минут при 20000g. Для осаждения тайтина супернатант разбавляли в 5 раз (конечная ионная сила ~0.05) охлажденной бидистиллированной водой, содержащей 0.1 мM ДТТ и 0.1 мM NaN3. Через 40–60 минут осадок, содержащий преимущественно тайтин, собирали центрифугированием в течение 30 минут при 15000 g. Осадок растворяли в минимальном объеме буфера, содержащего 0.6 М KCl, 30 мM KH2PO4, 1 мM ЭГТА, 0.1 мM ДТТ, 0.1 мM NaN3, pH 7.0, и осветляли в течение 60 минут при 20000 g. Тайтин очищали методом гель-фильтрации на колонке с носителем Sepharose–CL2B, уравновешенным в этом же буфере.

Популярные статьи:

Лейкоциты, их виды и физиологическое значение
Лейкоциты содержатся в периферической крови в концентрации 4-9 ´ 109 /л. Увеличение количества лейкоцитов называется лейкоцитозом, снижение - лейкопенией. Причиной лейкопении являются токсические и радиационные воздействия на органи ...

Время возникновения
Если отбросить библейскую легенду о сотворении человека, то вопрос о времени появления современного человека на нашей планете стал занимать умы ученых сравнительно недавно – каких-нибудь 40-50 последних лет, так как до этого обсуждалась в ...

Общие размышления о нейронной специфичности
В последнее время наблюдается значительный прогресс в нашем понимании того, как нервная клетка находит свои мишени и устанавливает связи. Однако когда начинаешь рассуждать о несчетном количестве связей, которые должны сформироваться во вр ...