Выделение тайтина из скелетных мышц

Тайтин из скелетных мышц кролика выделяли по методу (Soteriou et al., 1993) с модификациями. Мышцы гомогенизировали в 3-х кратном (по отношению к массе мышц) объеме раствора, содержащего 50 мМ KCl, 5 мM ЭГТА, 1 мM NaHCO3,, 1 мM ДТТ, 0.1 мM NaN3, pH 7.0. Для уменьшения деградации тайтина в процессе выделения в раствор добавляли набор ингибиторов протеаз: 1 мM PMSF, 20 мкг/мл ингибитора трипсина, 10 мкг/мл леупептина.

Полученный мышечный гомогенат центрифугировали в течение 5–10 минут при 2500 g. Супернатант отбрасывали, а процедуру промывки повторяли 5–6 раз. К промытому осадку добавляли 2-х кратный объем экстрагирующего раствора, содержащего 0.9 М KCl, 2 мM MgCl2, 2 мM ЭГТА, 0.5 мM ДТТ, 0.1 мM NaN3, 1 мM PMSF, 10 мM имидазола-HCl, pH 7.0. Раствор также содержал 40 мкг/мл соевого ингибитора трипсина и 20 мкг/мл леупептина.

Экстракция проводилась на льду при 4˚С в течение 10–15 минут при непрерывном перемешивании. Экстракт осветляли в течение 40 минут при 14000 g и супернатант разбавляли в 3 раза охлажденной бидистиллированной водой, содержащей 0.1 мM ДТТ и 0.1 мM NaN3, для преципитации актомиозина (конечная ионная сила ~0.2). Через 1 час супернатант осветляли в течение 60 минут при 20000g. Для осаждения тайтина супернатант разбавляли в 5 раз (конечная ионная сила ~0.05) охлажденной бидистиллированной водой, содержащей 0.1 мM ДТТ и 0.1 мM NaN3. Через 40–60 минут осадок, содержащий преимущественно тайтин, собирали центрифугированием в течение 30 минут при 15000 g. Осадок растворяли в минимальном объеме буфера, содержащего 0.6 М KCl, 30 мM KH2PO4, 1 мM ЭГТА, 0.1 мM ДТТ, 0.1 мM NaN3, pH 7.0, и осветляли в течение 60 минут при 20000 g. Тайтин очищали методом гель-фильтрации на колонке с носителем Sepharose–CL2B, уравновешенным в этом же буфере.

Популярные статьи:

Важнейшие запреты у биовидов
Все запреты возникают под жестким давлением отбора ради выполнения задачи сохранения вида. К важнейшим из таких запретов относятся следующие: 1. «Не убей своего» - первый и основополагающий запрет у очень многих видов. Чтобы выполнить ег ...

Влияние вторичной структуры ДНК
В электрофоретическом поведении однонитевых (денатурированная ДНК, РНК) и двунитевых молекул нуклеиновых кислот многое определяется их размерами. В случае коротких полинуклеотидных цепей их нативная двунитевая молекула имеет более жесткую ...

Декорирование гостиной
Гостиная - комната, в которой собирается семья. Это помещение, в котором в основном и располагают комнатные растения в обычном доме. Именно здесь располагают самые красивые и дорогие растения. Каждую гостиную можно сделать еще уютнее, доб ...