Электрофорез нуклеиновых кислот

Главное, что с точки зрения электрофореза отличает нуклеиновые кислоты от белков — это значительный по величине суммарный отрицательный заряд, обусловленный диссоциацией многочисленных остатков фосфорной кислоты в связях между нуклеозидами. рН окружающей среды мало влияет на этот заряд. Поэтому электрофорез можно вести не в буфере, а в любом подходящем ионосодержащем растворе, например в слабом растворе щелочи. Во всех случаях в жидкую среду вносят ЭДТА до концентрации 1—2 mM. Это необходимо для блокирования действия нуклеаз и предупреждения осаждения (особенно РНК) двухвалентными металлами.

Таким образом, разделение фрагментов ДНК и РНК электрофорезом приходится вести только по размеру. Однако размеры эти могут варьировать в очень широких пределах: от десятков нукле-отидных звеньев до многих сотен тысяч, а если выражать через молекулярные массы, то от нескольких тысяч до сотен миллионов дальтон.

Естественно, что для фракционирования относительно коротких фрагментов используют электрофорез в ПААГ, а для разделения высокомолекулярных ДНК, более крупнопористый носитель — агарозу. С ней мы познакомимся чуть позже. А пока в порядке связи с предыдущими параграфами уместно сделать несколько замечаний об электрофорезе ДНК в ПААГ. В нижеследующей таблице представлены рекомендации по выбору пористости геля в зависимости от размеров относительно коротких фрагментов ДНК, охарактеризованных числом пар оснований (п.о.):

В последнем диапазоне этой таблицы находятся предельные размеры ДНК, доступные автоматическому секвенированию последовательности нуклеотидов. Этот революционный метод анализа ДНК будет рассмотрен в следующей главе.

Сейчас же, прежде, чем перейти к электрофорезу в агарозе, я хочу познакомить учащихся и читателей с новыми идеями фракционирования крупных фрагментов ДНК в ПААГ с оригинальным использованием импульсов электрического напряжения, подаваемых на гель. Эти импульсы подаются поочередно в двух взаимно перпендикулярных направлениях. Идея здесь заключается вот в чем. Даже очень длинная и гибкая молекула ДНК может протиснуться через относительно малые поры геля, если она вытянута в направлении продвижения к «основному» аноду, скажем, расположенному внизу пластинки. Напряжение на этот анод подается не постоянно, а импульсами. Второй, «вспомогательный» анод создает напряженность электрического поля, перпендикулярную основному направлению движения ДНК к низу пластинки. Напряжение на него подается тоже достаточно мощными, но более короткими импульсами, чем на основной анод, чередуясь с ними.

Назначение «перпендикулярного» электрического поля состоит в том, чтобы поворачивать длинные молекулы больших ДНК так, чтобы в момент подачи «продольного» импульса они находились в положении, благоприятном для движения вдоль пластинки вниз, к основному аноду. Чем длиннее цепи ДНК, тем медленнее они будут менять свою ориентировку и потому медленнее подвигаться в нужном направлении. Авторы метода утверждают, что таким образом в ПААГ им удавалось разделять фрагменты ДНК длиной до пяти миллионов пар оснований.

Предложено несколько вариантов использования этой идеи. В одном из них чередующиеся импульсы одинаковой силы направлены каждый под углом 45° к продольной оси пластины, навязывая таким образом молекулам ДНК движение зигзагом, своего рода «рыскание». (Идея, по всей видимости, почерпнута из практики проталкивания через густую толпу людей.)

Популярные статьи:

Биотехнология в основных направлениях медицины
Медицинские биотехнологии подразделяются на диагностические и лечебные. Диагностические медицинские биотехнологии подразделяются на химические (определение диагностических веществ и параметров их обмена) и физические (определение физичес ...

Регуляция скольжения белками микрофиламентов
В мышечных клетках актиновые нити содержат (кроме, актина) два регуляторных белка — тропомиозин и тропонин, благодаря которым скольжение чувствительно к концентрации ионов Са2+. Связывание комплекса миозин — АТР с актином возможно только ...

Процессинг и посттрансляционная модификация нейропептидов
Общий принцип синтеза всех достаточно изученных НП состоит в образовании относительно больших пептидов-предшественников, из которых после завершения трансляции выщепляются протеазами соответствующие НП. Как правило, в состав пептида-предш ...