Молекулярная масса субъединиц

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецил-сульфата натрия — это обычная методика, но в случае интегральных мембранных белков при ее применении возникают особые проблемы. В этом методе додецилсульфат связывается с полипептидными цепями, и комплексы белок—ДНС разделяются в полиакриламидном геле в соответствии с их стоксовыми радиусами, которые в большинстве случаев зависят от молекулярной массы. Молекулярную массу определяют, сравнивая электрофоретическую подвижность данного комплекса и известного стандарта. Однако связывание ДСН с неизвестным белком может качественно отличаться от связывания со стандартами, и тогда будет получен неправильный результат. Подобная ситуация наблюдается для интегральных мембранных белков с высоким содержанием неполярных аминокислотных остатков. С большинством растворимых белков ДСН образует комплексы в соотношении 1,4 г ДСН на 1 г белка, а с белками, содержащими большой процент неполярных остатков, может связываться больше детергента. Возникающий при этом дополнительный отрицательный заряд приводит к аномальному повышению электрофоретической подвижности, и определяемая молекулярная масса оказывается меньше, чем на самом деле. Возможна и другая ситуация. Связывающийся с ДСН мембранный белок может находиться в не полностью развернутом состоянии, что тоже приведет к аномальному повышению электрофоретической подвижности из-за образования более компактного комплекса белок—ДСН. Все эти эффекты весьма существенны. Например, лактозопермеаза имеет кажущуюся мол. массу 33 ООО, если измерять ее с помощью электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН; в действительности же, как показывают результаты генетического анализа, ее мол. масса равна 46 ООО. Во многих случаях удается оценить молекулярную массу более точно, если построить график Фергюсона, представляющий собой зависимость электрофоретической подвижности от содержания акриламида как для стандартных белков, так и для исследуемого белка. Этот график зависит от радиуса Стокса и в меньшей степени — от заряда комплекса. Например, по результатам электрофореза в 12%-ном акриламидном геле одна из субъединиц цитохромно-го комплекса Е. coli имеет кажущуюся мол. массу 28 ООО, а из графика Фергюсона получается величина 43 ООО, что совпадает с мол. массой, рассчитанной по данным о секвенировании соответствующей ДНК.

Еще одна проблема — возможное наличие четвертичной структуры. Некоторые мембранные белки агрегируют даже в присутствии ДСН. Например, гликофорин А или белок оболочки бактериофага М13 при электрофорезе в полиакриламидных гелях с ДСН находятся в основном в виде димеров. Иногда агрегация еще более усиливается при нагревании смеси белок—ДСН. Такая картина наблюдается, например, для субъединиц как митохондри-альной, так и бактериальной терминальных оксидаз. Чтобы оценить способность белка к необратимой агрегации, следует провести сравнительный анализ результатов электрофореза в полиакрила-мидном геле с ДСН для прогретых и непрогретых проб. Сходная проблема иногда возникает из-за присутствия детергента, использованного при очистке мембранного белка. Этот детергент необходимо удалить и заменить на ДСН, поскольку в некоторых случаях наблюдается четкая зависимость электрофоретической подвижности от присутствия детергента, с помощью которого солюбилизнровали фермент.

Итак, есть основания думать, что оценка молекулярной массы субъединиц сильно неполярных интегральных мембранных белков, определенная с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН, может оказаться неверной. К несчастью, простая альтернатива этому методу отсутствует, и правильную величину часто получают либо по данным о полной первичной последовательности, либо с помощью точного гидродинамического анализа.

Популярные статьи:

Половозрелая структура популяции
Иерархические системы самцов и самок в стае в некоторой степени обособлены – у самок своя иерархия, у самцов своя, но устанавливается она не без влияния особей противоположного пола. То есть конкуренция за более высокий ранг между особями ...

Вывод
Различные формы изменчивости не могут объяснить поступательный эволюционный процесс, всегда носящий приспособительный характер. Наследственность хотя и может объяснить сходство особей в ряду поколений с родоначальной родительской парой, н ...

Функциональное состояние кардио-респираторной системы
Важное место в адаптации, особенно к физическим нагрузкам, имеет состояние кардио-респираторной (сердечно-сосудистая и дыхательная системы) системы. Кроме того, от состояния данной системы во многом зависит становление остальных систем ор ...