Выделение внутриклеточных ферментов

Материалы » Способы получения ферментов » Выделение внутриклеточных ферментов

Во введении в данную главу отмечалось, что выделение внутриклеточных ферментов требует фракционирования весьма сложной смеси продуктов по сравнению с простой обработкой внеклеточной культуральной жидкости при получении соответствующих ферментов. Это фракционирование за последние 50 лет закреплено во многих конкретных методах обработки. Среди работников лабораторий укоренилась тенденция рассматривать каждый метод выделения ферментов как уникальный. Несомненно справедливо, что каждый фермент отличается специфичностью, но мнение о том, что для каждого фермента метод выделения должен быть обязательно свой, ведет к замедлению создания технологии и отдельных ее операций. А фактически анализ любого набора практических рецептов для выделения ферментов показывает, что широко применяется в реальных условиях лишь относительно небольшое число процедур. Безусловно, промышленное выделение внутриклеточных ферментов требует большей гибкости при применении различных методов, чем выделение внеклеточных ферментов. Тем не менее, и для выделения внутриклеточных ферментов может быть разработана относительно стабильная технология и оборудованы производственные линии. Выделение аспарогеназы на промышленном уровне подтверждает дальнейшие возможности совершенствования этого процесса.

Ферментация. Вместимость встряхиваемых на качалке колб 250 мл, ферментаторов от 400 л до 75,7 м3 (выход снижается до 70%). Среда — настой пшеницы; критический питательный компонент—аминокислоты; мощность подводимой энергии 0,3—0,4 л. с./378,5 л.

Выделение клеток. Дисковая центрифуга с соплами (1300 g), производительность 26.5 л/мин. Концентрирование от 6 г/л до 120 г/л (по массе СВ).

Разрушение клеток. Гомогенизатор APV фирмы «Manton Gaulin»,— 2- кратное пропускание (563 кг на см2); при первом пропускании высвобождается 90% фермента, при втором —97%; подъем температуры до 30 °С; охлаждение рассолом.

Отделение остатков клеток и белка. Добавление 3 3% этанола (пол слои жидкости); удаление твердой фазы под давлением на ротационном фильтре (11,25 м2); за время менее 2 ч получается 7570 л фильтрата. Осаждение фермента. 50 % метанола; пониженные значения рН.

Фильтрация. Фильтр-пресс (1,62 м); добавление кизельгура; ресуспендирование фермента в 946,25 л воды. Переосаждение фермента. 60% метанол.

Отделение твердой фазы: С помощью центрифуги Шарплес с трубчатой корзиной.

Концентрирование. Путем ультрафильтрации (выход 90 %).

Хроматография. Сефадекс DEAE-A50 (колонка: диаметр 29,48 см. высота 58.96 см); исходный буфер 0.025М до 0.12М; осаждение фермента; ресуспендирование; хроматография с помощью СМ-целлюлозы (0,11 г белка/г полимера); снижение содержания пирогенных веществ.

Кристаллизация. С помощью 0,6 объема этанола; рН 5. Сбор осадка с помощью центрифуги с твердой корзиной.

Стерилизация. Обработка углем, стерилизующая фильтрация; обработка маннитолом; сушка сублимацией.

Выход. 1 кг кристаллической аспарагиназы (30%—общий выход); длительность всего цикла —24 ч; многочисленные стадии обработки перед ультрафильтрацией; стерилизация, которая не полностью касается аспарагиназы; ламинарное движение воздуха; вода, свободная от пирогенных веществ.


Популярные статьи:

Пространство, время, симметрия. Принципы симметрии, законы сохранения
Понятие симметрии в естествознании: инвариантность относительно тех или иных преобразований Нарушенные (неполные симметрии) Эволюция как цепочка нарушений симметрии Простейшие симметрии: - однородность (одинаковые свойства во всех точ ...

Как работает теломераза
Теломераза – это фермент‚ синтезирующий тандемно повторяющиеся сегменты ДНК, из которых состоит G-цепь теломерной ДНК. - она относится к классу ДНК-полимераз - теломераза - это РНК-зависимая ДНК-полимераза или обратная транскриптаза. - ...

Человек и биосфера. Концепции В.И. Вернадского о биосфере и феномене человека
В процессе создания концепции биосферы В.И. Вернадский приходит к выводу огромного мировоззренческого значения, по существу, определяющему стратегию будущего развития естествознания. Он говорит о том, что в современное научное мировоззрен ...