Полиакриламидный гель (ПААГ)

Страница 1

Это — продукт полимеризации акриламида. В результате разрывов двойных связей и конденсации по ним получаются длинные бесцветные нити линейного полимера полиакриламида. Эти нити могут быть ковалентно связаны («сшиты») между собой.

Конечно, в реальных полимерах нити полиакриламида вовсе не параллельны, а расположены хаотически, но в отдельных точках своего сближения они сшиты мостиками «Биса». Получаются неправильной формы поры пространственной решетки, средний размер которых, тем не менее, определяется частотой расположения сшивок и концентрацией основных нитей полимеров.

Оба мономера: акриламид и «Бис» представляют собой хорошо растворимые в водной среде порошки. Образование пространственной сетки геля происходит прямо в растворе выбранного буфера, который благодаря этому заполняет все поры геля.

Полимеризацию стимулируют добавки в малых количествах еще двух веществ. Одно из них служит инициатором процесса полимеризации, второе — ускоряет этот процесс.

Содержание водной фазы в геле очень велико — от 70 до 97%.

Пористость и механические характеристики ПААГ задают путем выбора процентного отношения суммарной массы обоих полимеров к объему геля. Эту величину принято обозначать буквой Т. Практически она варьирует от 3 до 30%. Вес сшивки («Биса») составляет обычно от 1 до 5% суммарного веса мономе-ров. Эту величину обозначают буквой С. При малых значениях сшивки (С<2%) ПААГ нельзя считать жесткой регулярной пространственной решеткой. Скорее это — длинные нити, лишь в отдельных точках, случайным образом связанные между собой. Расстояние между этими точками вдоль нити в среднем составляет 50—100 мономерных единиц. Мигрирующие в геле молекулы белка могут раздвигать длинные, гибкие участки линейных полимеров акриламида. На это расходуется энергия, что также сказывается замедлением миграции.

ПААГ хорошо прилипает к чисто вымытому стеклу.

В свободной жидкости скорость миграции большинства кислых белков при рН8,5 составляет 0,1-0,5 см/час при напряженности поля 1 В/см. Для эффективного разделения белков в ПААГ, как показывает опыт, средняя скорость их миграции (благодаря сопротивлению геля) должна быть в 5-10 раз меньше. При нормальной напряженности электрического поля в 10-20 В/см этому соответствует средняя скорость миграции белков в геле порядка 0,1-2 см/час. Таким образом, при рабочей длине геля в 20 см за 10 часов электрофореза наиболее быстрые белки могут достигнуть нижнего конца геля в то время, как наиболее медленные продвинутся лишь на 1 см. Напряжение, которое при этом должно подаваться на трубочку геля, составит 200—400 В. Цифры эти, конечно, сугубо ориентированные.

Выбор значения Т зависит от характера электрофоретических подвижностей белков в геле. Если сильно различаются размеры белковых молекул, а отношение заряда к массе у них более или менее одинаковое, то имеет смысл выбрать Т максимальным. Разделение в этом случае будет происходить в основном за счет трения о гель. Причем тем эффективнее, чем больше Т, хотя при этом в связи с увеличением продолжительности электрофореза усилится диффузия белков в полосах. Если же компоненты анализируемой смеси имеют заведомо различные отношения заряда к массе, то может оказаться выгодным вести разделение в крупнопористом геле (при малых значениях Т), то есть как бы в свободной жидкости.

Популярные статьи:

Показатели селективности лова при отцеживании
За основу оценки селективных свойств сетных полотен примем выражения для кривой селективности в виде логистической кривой (Мельников А.В.,1985). Уточнения в этом выражении связаны, прежде всего, с отсутствием для многих видов лова доли ры ...

Мониторинг функционального состояния организма. Ортостатическая проба
Многократно подсчитывается пульс ( по возможности и артериальное давление) до получения стабильного результата в положении стоя и в положении лёжа. Затем делаются те же измерения сразу же после изменения положения тела и по истечении 1, 3 ...

Биохимические микрочипы
Биохимические микрочипы, технологии производства и внедрения которых активно развиваются в России и за рубежом, являются сильнейшими из существующих инструментов для выявления и идентификации биологических материалов. В основе применения ...