Полиакриламидный гель (ПААГ)Страница 1
Это — продукт полимеризации акриламида. В результате разрывов двойных связей и конденсации по ним получаются длинные бесцветные нити линейного полимера полиакриламида. Эти нити могут быть ковалентно связаны («сшиты») между собой.
Конечно, в реальных полимерах нити полиакриламида вовсе не параллельны, а расположены хаотически, но в отдельных точках своего сближения они сшиты мостиками «Биса». Получаются неправильной формы поры пространственной решетки, средний размер которых, тем не менее, определяется частотой расположения сшивок и концентрацией основных нитей полимеров.
Оба мономера: акриламид и «Бис» представляют собой хорошо растворимые в водной среде порошки. Образование пространственной сетки геля происходит прямо в растворе выбранного буфера, который благодаря этому заполняет все поры геля.
Полимеризацию стимулируют добавки в малых количествах еще двух веществ. Одно из них служит инициатором процесса полимеризации, второе — ускоряет этот процесс.
Содержание водной фазы в геле очень велико — от 70 до 97%.
Пористость и механические характеристики ПААГ задают путем выбора процентного отношения суммарной массы обоих полимеров к объему геля. Эту величину принято обозначать буквой Т. Практически она варьирует от 3 до 30%. Вес сшивки («Биса») составляет обычно от 1 до 5% суммарного веса мономе-ров. Эту величину обозначают буквой С. При малых значениях сшивки (С<2%) ПААГ нельзя считать жесткой регулярной пространственной решеткой. Скорее это — длинные нити, лишь в отдельных точках, случайным образом связанные между собой. Расстояние между этими точками вдоль нити в среднем составляет 50—100 мономерных единиц. Мигрирующие в геле молекулы белка могут раздвигать длинные, гибкие участки линейных полимеров акриламида. На это расходуется энергия, что также сказывается замедлением миграции.
ПААГ хорошо прилипает к чисто вымытому стеклу.
В свободной жидкости скорость миграции большинства кислых белков при рН8,5 составляет 0,1-0,5 см/час при напряженности поля 1 В/см. Для эффективного разделения белков в ПААГ, как показывает опыт, средняя скорость их миграции (благодаря сопротивлению геля) должна быть в 5-10 раз меньше. При нормальной напряженности электрического поля в 10-20 В/см этому соответствует средняя скорость миграции белков в геле порядка 0,1-2 см/час. Таким образом, при рабочей длине геля в 20 см за 10 часов электрофореза наиболее быстрые белки могут достигнуть нижнего конца геля в то время, как наиболее медленные продвинутся лишь на 1 см. Напряжение, которое при этом должно подаваться на трубочку геля, составит 200—400 В. Цифры эти, конечно, сугубо ориентированные.
Выбор значения Т зависит от характера электрофоретических подвижностей белков в геле. Если сильно различаются размеры белковых молекул, а отношение заряда к массе у них более или менее одинаковое, то имеет смысл выбрать Т максимальным. Разделение в этом случае будет происходить в основном за счет трения о гель. Причем тем эффективнее, чем больше Т, хотя при этом в связи с увеличением продолжительности электрофореза усилится диффузия белков в полосах. Если же компоненты анализируемой смеси имеют заведомо различные отношения заряда к массе, то может оказаться выгодным вести разделение в крупнопористом геле (при малых значениях Т), то есть как бы в свободной жидкости.
Популярные статьи:
Устойчивость биосферы
Какова устойчивость биосферы, то есть ее способность возвращаться в исходное состояние после любых возмущающих воздействий? Она очень велика. Биосфера существует уже около 3,8 миллиардов лет (Солнце и планеты - около 4,6 миллиарда) и за э ...
Генетика как наука о наследственности
Генетика (от греч. genesis - происхождение), наука о наследственности и изменчивости живых организмов и методах управления ими. Генетика по праву может считаться одной из самых важных областей биологии. На протяжении тысячелетий человек ...
Океан.
Океан (греч. Okeanos) (Мировой океан), непрерывная водная оболочка Земли, окружающая материки и острова и отличающаяся общностью солевого состава. По существу Земля — это водная планета, так как Мировой океан занимает 70,8% ее территории. ...