Электрофорез белков в вертикальных пластинах
Страница 1

Материалы » Полиакриламидный гель (ПААГ) » Электрофорез белков в вертикальных пластинах

Первые опыты с электрофорезом белков ставились в вертикально стоящих трубочках. Для простоты изложения я в этой системе рассматривал и основные особенности электрофореза, не зависящие от формы геля. Однако в ходе эксплуатации довольно скоро выяснилось, что система трубочек неудобна в двух отношениях. Во-первых, в трубочке трудно добиться одинакового охлаждения геля по всему ее сечению. Во-вторых, для сравнения результатов электрофореза нескольких сопоставляемых препаратов белков нужно было приготовить столько же отдельных трубочек в совершенно одинаковых условиях состава и полимеризации ПААГ, что затруднительно. Поэтому с середины 70-х годов электрофорез белков ведут исключительно в вертикально расположенных пластинах (рис. 1).

2-ПРОКЛАДКИ; 3-ПЛЕНКА; 4-ЗАЖИМ

Рис. 1

Обычно используют пластины шириной 8-14 см и длиной до 30 см. Полимеризацию акриламида, а затем и сам электрофорез ведут в форме, образованной двумя пластинами зеркального стекла толщиной 5 мм. Переднее стекло (на рис. 37) имеет вырез, назначение которого будет ясно из дальнейшего.

Расстояние между пластинами, — а значит и толщина геля, — задается толщиной прокладок из тефлона (0,4-1,5 мм) при ширине 10-15 мм (на рисунке они показаны пунктиром). Эти прокладки устанавливают по бокам и внизу формы, при условии плотного прилегания нижней прокладки к торцам боковых. Нижняя прокладка — немного выступает за пределы формы, поскольку после затвердевания геля ее надлежит удалить. Тефлон хорошо прилегает к зеркальному стеклу, а нижние торцы боковых прокладок можно слегка смазать силиконовым маслом. Прокладки между стеклами надежно зажимают по всей периферии пружинными зажимами для бумаг. (На рисунке показаны только 4 зажима с одной стороны пластины.) Вся камера таким образом должна быть надежно герметизирована, кроме верхнего ее края, на то время, пока в ней будет проходить полимеризация жидкой смеси предшественников ПААГ.

По окончании этого процесса (о чем можно судить по образованию резкой границы между гелем и тонким слоем воды, которым защищают полимеризацию от контакта с кислородом воздуха) зажимы можно снять. Полимеризация занимает обычно 30-40 минут.

В аналитических опытах на каждой пластине в параллельных «треках» ведут электрофорез нескольких препаратов, состав которых затем можно сопоставлять при строго одинаковых условиях разделения (рис.2 ).

Рис2.

Для фиксации этих треков в ходе полимеризации на верхнем крае геля формируют ряд одинаковых углублений прямоугольной формы «карманов», куда затем и вносят различные препараты.

Для этого в еще не заполимеризовавшийся гель вставляют «гребенку» из тефлона, такой же толщины, как прокладки между стеклами. Как видно на разрезе, верхняя часть гребенки делается немного толще, чем нижняя (с зубцами). Это удобно так как позволяет устанавливать гребенку каждый раз одинаково и ровно — до упора в торец стеклянной пластины. Жидкий гель заливают между пластинами с таким расчетом, чтобы при опускании гребенки до упора он заполнял бы промежутки между ее зубцами. Торцы зубцов гребенки перед установкой смачивают, потерев их об стекло с налитым на него жидким гелем. Кроме того начинают вставлять ее с некоторым перекосом, следя за тем, чтобы под зубцами не задержались пузырьки воздуха.

После завершения полимеризации геля снимают зажимы, удаляют нижнюю прокладку и вынимают гребенку. Весь «сэндвич» сохраняет свою целостность благодаря прилипанию ПААГ к стеклу. Его устанавливают в простой прибор, склеенный из оргстекла — его нетрудно изготовить в лабораторных условиях (рис. 3). Так, чтобы то стекло формы геля, которое имеет вырез, прилегало к верхнему резервуару прибора. Вырезы в стекле и резервуаре совпадают, а второе, не вырезанное стекло формы геля, замыкает собой объем резервуара.

Рис. 3

Его можно заполнять буфером, который таким образом попадает и в карманы геля. Естественно, что всю форму с гелем надо хорошо прижать к стенке прибора (лучше через резиновую прокладку), чтобы предотвратить вытекание буфера из верхнего резервуара. На дне коробки нижнего резервуара видна опора, на которую ставят пластины с гелем. Выемка на этой опоре обеспечивает контакт нижнего буфера с нижним торцом геля. Необходимо проверять, что на этом торце тоже нет пузырьков воздуха.

Страницы: 1 2


Популярные статьи:

Австралопитек (Australopithecinae)
Австралопитеки - род высших двуногих человекообразных приматов, обитавших преимущественно в Восточной и Южной Африке от 4 до 1 млн. лет назад. Австралопитеки имели небольшое тело (длина в среднем 120-130 см), объем мозга колебался от 300 ...

Определение смерти с точки зрения науки
Смерть, прекращение жизнедеятельности организма и вследствие этого — гибель индивидуума как обособленной живой системы, сопровождающаяся разложением белков и других биополимеров, являющихся основным материальным субстратом жизни. В основе ...

Конкурентные взаимодействия во время развития
После того как аксон достигает своих мишеней и образует синаптические связи, два процесса управляют паттерном иннервации. Одним является период гибели клеток, когда большое количество нейронов, которые установили синаптические связи, поги ...