Изготовление биологических чипов
Страница 1

На основании экспериментальных данных была разработана технология для крупномасштабного изготовления стеклянных подложек при производстве ДНК‑чипов. Для широкого применения чиповых технологий необходимы простые, дешевые и эффективные методы изготовления в больших масштабах и контроля модифицированных подложек, содержащих поверхностные аминогруппы Наиболее часто используемыми твердыми подложками для изготовления микрочипов являются стекла, обработанные различными аминоалкилтриалкоксисиланами, например APTES (3-аминопропилтриэтоксисилан,Рис.3) для получения модифицированной поверхности.

б

Рис.3 Структурная формула APTES. а-в свободном состоянии, б-модифицированная на стекле [4]

Такая поверхность является гидрофобной и позволяет наносить зонды с максимальной плотностью. Как следует из литературных данных, условия получения амино-модифицированной стеклянной подложки могут быть весьма разнообразными. Это касается как концентрации APTES, так и выбора растворителя, который, в свою очередь, может содержать различное количество воды. Для изготовления амино-модифицированных подложек в больших масштабах желательно использовать как можно менее токсичные и дешевые растворители, такие как ацетон и этанол. Показано, что природа органического растворителя практически не влияет на качество получаемых стекол. Активация нуклеиновых кислот осуществляется при помощи карбодиимидов(CDI)- это один из ранних методов получения аффинных сорбентов, который до сих пор остается достаточно распространенным. В основе метода лежит способность карбодиимидов активировать концевую фосфатную группу нуклеиновых кислот. Активированные карбодиимидом олигонуклеотиды легко вступают в реакцию с амино- или сульфгидрильными группами носителей. К настоящему времени достаточно подробно изучен механизм активации карбодиимидами фосфатных групп олигонуклеотидов. Лимитирующей стадией реакции является протонирование карбодиимидов с образованием промежуточных неустойчивых реакционноспособных О‑фосфорилизомочевины. Достаточно сильные нуклеофильные группы носителя могут ингибировать эту стадию[4]

Рис. 4 Механизм активации НК карбдиимидом.[4]

Кроме того, протонированные нуклеофильные группы не способны вступать в реакцию с соединениями 1 [Рис.4]. Вследствии этого выход конечного продукта 2 при использовании полимеров с высокоосновными группами может уменьшиться. Замещенные О-фосфорилизомочевины 3 способны также трансформироваться в побочные продукты, например гидролизоваться с высвобождением исходной фосфатной группы и мочевины, либо претерпевать ряд последовательных превращений с образованием пирофосфатов, полифосфатов и производных О-фосфорилизомочевины. Последние, в свою очередь, могут дать нереакционноспособные производные N‑пирофосфорилмочевины 3 или N‑фосфорилмочевины 4.

Для увеличения эффективности иммобилизации нуклеотидов на полимер активацию карбодиимидами проводят в присутствии нуклеофильного катализатора – имидазола, образующий соответствующий фосфамид олигонуклеотидов, который после протонирования остатков азола является высокореакционноспособным соединением по отношению к нуклеофилам. Чаще всего получаются фосфоимидазолиды 5 (Рис. 5)

Рис. 5 Механизм активации НК карбдиимидом в присутствии имидазола.[4]

Преимуществом этого подхода является отсутствие ряда побочных реакций, поскольку производное 5 стабильнее, чем О‑фосфорилмочевина 1. Соединение 5 более эффективно взаимодействует с аминогруппой носителя, что способствует увеличению выхода при иммобилизации.

Проведение гибридизации.

В основе гибридизационного анализа лежит использование комплементарного связывания нуклеотидов (Рис.6,б). Известные в настоящее время реакции можно разделить на две большие группы. Первая группа методов основана на амплификации – циклически повторяющейся репликации in vitro искомого фрагмента ДНК (РНК). Амплифицированный фрагмент затем выявляется путем электрофореза в геле. Ко второй группе относятся методы прямого обнаружения специфической последовательности нуклеотидов (ДНК или РНК) при помощи коротких олигонуклеотидных одноцепочечных фрагментов, имеющих репортерную группу (зонд). Эти реакции получили название ДНК-зондирования. Их чувствительность зависит от вида используемого зонда и может быть весьма высокой. Наиболее распространенной нерадиоактивной репортерной группой, включаемой в состав олиго- и полинуклеотидных зондов, является витамин биотин (природный кофактор группы ферментов – карбоксилаз)(Рис 6,А)

Страницы: 1 2


Популярные статьи:

Тератогены в окружающей среде
В чем же причины рождения детей с пороками развития? Есть все основания, чтобы с достаточной уверенностью ответить: одна из таких причин - изменение химического состава окружающей человека среды. Сегодня уже известно несколько десятков с ...

Энергетическая характеристика экосистемы
Поток вещества - перемещение последнего в форме химических элементов и их соединений от продуцентов к редуцентам (через консументы или без них).Поток энергии - переход энергии в виде химических связей органических соединений (пищи) по цеп ...

Абсолютное и относительное время
С самого начала следует четко сказать, что наша попытка объяснить морфологическую эволюцию в терминах генетики развития будет постоянно тормозиться своеобразием предмета, доводящим порой до отчаяния. В отличие от очевидных физиологических ...