Получение ДНК-фрагментов желаемого размера

Страница 2

9. Важно, чтобы ДНК, которую предстоит клонировать, не подвергалась ультрафиолетовому облучению. Поэтому отрежьте края геля, содержащие маркеры, а также небольшое количество рестрицированной геномной ДНК, окрасьте их бромидом этидия и визуализируйте в ультрафиолете. По полученным данным определите участок геля с интересующей вас ДНК.

10. Вырежьте нужный участок геля. На этой и последующих стадиях важно использовать безнуклеазные реактивы и инструменты. Выделять ДНК из геля для получения кольцевой молекулы можно двумя способами. Нам представлялось удобным делать это методом электроэлюции. Поместите кусочек геля с ДНК в диализный мешок, залейте четырьмя объемами электрофорезного буфера, а затем поместите мешок в камеру для горизонтального электрофореза. Элюируйте ДНК из геля в течение двух часов 0,5хТВЕ-буфером при постоянном напряжении 100 В. Чтобы убедиться, что вся ДНК элюирована, можно вскрыть диализный мешок, достать гель и окрасить бромидом этидия. После удаления геля снова запечатайте диализный мешок и отдиали-зуйте ДНК против 10 мм Трис, рН 7,4, 1 мм ЭДТА с несколькими сменами буфера, подготовив таким образом препарат для лигирования.

11. Препаративные гели для определения размеров ДНК можно готовить из легкоплавкой агарозы. И тогда выделять ДНК из них можно, вырезая нужные участки и расплавляя их при 65°С. После того как гель расплавится, ДНК доводят до нужной концентрации и проводят лигирование в присутствии агарозы, которая не ингибирует эту реакцию. В настоящее время нет оснований предпочитать один метод другому. Важно лишь избегать операций, которые могли бы нарушить целостность молекул ДНК после извлечения их из геля. Нельзя центрифугировать, встряхивать, пипетировать препараты. И желательно как можно скорее приступать к их лигированию.

Популярные статьи:

Повышение стабильности протопластов
Наиболее остро стоит вопрос о получении растений, устойчивых к вредителям сельского хозяйства (прежде всего к фитопатогенным грибам и насекомым), так как болезни растений стали основным лимитирующим фактором получения урожая. Было обнару ...

Использование в образовательных учреждениях технических и аудиовизуальных средств обучения
Использование новых технических и аудиовизуальных средств повышения наглядность обучения и создает, казалось бы, условия для сохранения работоспособности. Но с другой – ТСО увеличивают объем информации, получаемой учащимися по сравнению с ...

Ионная избирательность лиганд-активируемых ионных каналов
Одной из характерных черт строения ионных каналов является то, что их внемембранные части значительно выдаются над поверхностью мембраны. Unwin отмечает, что в катионных каналах стенки выступающего вестибюля канала имеют избыточный отрица ...