Получение ДНК-фрагментов желаемого размера

Страница 2

9. Важно, чтобы ДНК, которую предстоит клонировать, не подвергалась ультрафиолетовому облучению. Поэтому отрежьте края геля, содержащие маркеры, а также небольшое количество рестрицированной геномной ДНК, окрасьте их бромидом этидия и визуализируйте в ультрафиолете. По полученным данным определите участок геля с интересующей вас ДНК.

10. Вырежьте нужный участок геля. На этой и последующих стадиях важно использовать безнуклеазные реактивы и инструменты. Выделять ДНК из геля для получения кольцевой молекулы можно двумя способами. Нам представлялось удобным делать это методом электроэлюции. Поместите кусочек геля с ДНК в диализный мешок, залейте четырьмя объемами электрофорезного буфера, а затем поместите мешок в камеру для горизонтального электрофореза. Элюируйте ДНК из геля в течение двух часов 0,5хТВЕ-буфером при постоянном напряжении 100 В. Чтобы убедиться, что вся ДНК элюирована, можно вскрыть диализный мешок, достать гель и окрасить бромидом этидия. После удаления геля снова запечатайте диализный мешок и отдиали-зуйте ДНК против 10 мм Трис, рН 7,4, 1 мм ЭДТА с несколькими сменами буфера, подготовив таким образом препарат для лигирования.

11. Препаративные гели для определения размеров ДНК можно готовить из легкоплавкой агарозы. И тогда выделять ДНК из них можно, вырезая нужные участки и расплавляя их при 65°С. После того как гель расплавится, ДНК доводят до нужной концентрации и проводят лигирование в присутствии агарозы, которая не ингибирует эту реакцию. В настоящее время нет оснований предпочитать один метод другому. Важно лишь избегать операций, которые могли бы нарушить целостность молекул ДНК после извлечения их из геля. Нельзя центрифугировать, встряхивать, пипетировать препараты. И желательно как можно скорее приступать к их лигированию.

Популярные статьи:

Размещение растений в комнате
Подвешивание к потолку . Нет лучше способа разместить вьющиеся растения, чем подвешенный к потолку или на кронштейн в стене. Висячие корзинки имеют свои недостатки. Их нельзя вешать в тех местах, где под ними будут ходить. Растение в вися ...

Здоровьесберегающие технологии и современная система образования. Представление о здоровьесберегающих образовательных технологиях
В условиях, когда образование стало всеобщим, а профессия учителя массовой, надеяться на индивидуальное мастерство педагога становится всё труднее. Поэтому в настоящее время педагоги и методисты ведут активные поиски дидактических средств ...

История изучения амилоидозов
Первое описание амилоидоза у человека относится к XVII веку, когда Боне сообщил результаты наблюдения больного с абсцессом печени и громадной селезенкой, содержащей множество белых камней (саговая селезенка). Дальнейшую историю изучения а ...