Получение ДНК-фрагментов желаемого размера
Страница 2

Материалы » Прыжки по хромосоме » Получение ДНК-фрагментов желаемого размера

9. Важно, чтобы ДНК, которую предстоит клонировать, не подвергалась ультрафиолетовому облучению. Поэтому отрежьте края геля, содержащие маркеры, а также небольшое количество рестрицированной геномной ДНК, окрасьте их бромидом этидия и визуализируйте в ультрафиолете. По полученным данным определите участок геля с интересующей вас ДНК.

10. Вырежьте нужный участок геля. На этой и последующих стадиях важно использовать безнуклеазные реактивы и инструменты. Выделять ДНК из геля для получения кольцевой молекулы можно двумя способами. Нам представлялось удобным делать это методом электроэлюции. Поместите кусочек геля с ДНК в диализный мешок, залейте четырьмя объемами электрофорезного буфера, а затем поместите мешок в камеру для горизонтального электрофореза. Элюируйте ДНК из геля в течение двух часов 0,5хТВЕ-буфером при постоянном напряжении 100 В. Чтобы убедиться, что вся ДНК элюирована, можно вскрыть диализный мешок, достать гель и окрасить бромидом этидия. После удаления геля снова запечатайте диализный мешок и отдиали-зуйте ДНК против 10 мм Трис, рН 7,4, 1 мм ЭДТА с несколькими сменами буфера, подготовив таким образом препарат для лигирования.

11. Препаративные гели для определения размеров ДНК можно готовить из легкоплавкой агарозы. И тогда выделять ДНК из них можно, вырезая нужные участки и расплавляя их при 65°С. После того как гель расплавится, ДНК доводят до нужной концентрации и проводят лигирование в присутствии агарозы, которая не ингибирует эту реакцию. В настоящее время нет оснований предпочитать один метод другому. Важно лишь избегать операций, которые могли бы нарушить целостность молекул ДНК после извлечения их из геля. Нельзя центрифугировать, встряхивать, пипетировать препараты. И желательно как можно скорее приступать к их лигированию.

Страницы: 1 2 


Популярные статьи:

Корпускулярно – волновой дуализм. Его сущность. Необычные свойства микрообъектов. Гипотеза де Бройля
В природе микрообъекты имеют необычные свойства, которые проявляются посредством экспериментов. Так учеными было установлено, что микрообъекты в одних опытах обнаруживают себя как материальные частицы, или корпускулы, в других — как волны ...

Здоровье человека, определение, многогранность форм его проявления (обзор литературы)
Понятие «Здоровье человека», на первый взгляд, представляется простым и ясным. Здоровый человек вообще не задумывается над смыслом этого состояния. Не случайно Ф.Энгельс в своё время сделал очень простое определение здоровья: «Здоровье – ...

Свертывание крови (генмостаз): свертывающая и противосвертывающая системы
Термином гемостаз обозначается каскад реакций, обеспечивающих прекращение кровотечения в случаях повреждения тканей и стенки сосудов. В организме здорового человека Кровь способна выполнять свои многочисленные жизненно важные функции при ...