Циклизация

Страница 1

Успех или неудача «прыжков по хромосоме» в решающей степени определяются возможностью лигировать большие сегменты ДНК с образованием кольцевых молекул. Анализ стратегии этого метода, схематически изображенной на рис. 4, показывает, что тандемное лигирование молекул ДНК дает сцепленные фрагменты, соединяющие в себе две случайные последовательности. Такое сцепление приводит к образованию аномальных клонов, которые провоцируют «прыжки по хромосоме» из данной стартовой точки на какую-то случайную последовательность генома. Свести к минимуму риск возникновения такого события можно, проводя лигирование при достаточно низких концентрациях ДНК так, чтобы на долю тандемных лигирований приходилось менее 5–10%.

Теория лигирования ДНК при низких концентрациях была разработана в 50-е годы Джекобсоном и Стокмайером. Для некоторых размеров последовательностей ДНК теоретические прогнозы подтвердились экспериментально. Очень полезно, например, следующее соотношение:

где j – концентрация молекул ДНК контурной длины / и сегментной длины b, при которой с равной вероятностью лигируются как разные молекулы, так и концы одной молекулы. Очевидно, что для эффективной циклизации лучше работать с концентрациями гораздо более низкими, чем /. Подставляя в уравнение известные параметры ДНК для водного раствора, его можно преобразовать следующим образом:

где т.п.н. – длина ДНК в тысячах пар нуклеотидов. При данной концентрации ДНК i – доля лигирований, приводящих к циклизации. Чтобы эта доля достигала 90%, работать следует с концентрацией ДНК, определяемой уравнением:

Обычно для получения 3х106 клонов в библиотеке, необходимо после расщепления циклизованных молекул ДНК иметь 0,5 мкг сцепленных фрагментов. Средний размер такого фрагмента 5 т. п.н., а это значит, что для осуществления прыжков в 100 т. п.н. необходимо иметь 10 мкг фракционированной по размеру ДНК; для прыжков в 200 т. п.н. – уже 20 мкг. На интенсивность лигирования влияют два фактора: 1) количество ДНК, необходимое для получения достаточного числа сцепленных фрагментов и создания геномной библиотеки. Это количество возрастает линейно с увеличением размера прыжка; 2) необходимость преимущественного получения циклизованных молекул. Интенсивность лигирования с циклизацией возрастает пропорционально квадратному корню длины молекул ДНК. Поэтому с увеличением размера прыжка объем лигазной смеси должен возрастать пропорционально 3/2 степени длины молекулы ДНК. В табл. 1 приведены стандартные параметры для создания геномной библиотеки, рассчитанной на прыжки в 100 т. п.н.

Очень важно маркировать в кольцевых молекулах места соединения фрагментов с тем, чтобы селективно клонировать их на последующих стадиях. В качестве селективного маркера мы использовали ген супрессорной тРНК – supF, хотя возможны и другие способы селекции. Супрессорный ген должен иметь концы, комплементарные Mfeol-концевым фрагментам геномной ДНК – Для этой цели было взято несколько supF с различающимися концевыми последовательностями, полученными при обработке рестриктазной Ват.

Ниже представлена методика реакции циклизации.

1. Используя приведенные выше уравнения, растворите ДНК и доведите раствор до нужной концентрации в 50 мМ Трис, рН 7,4, 1 мМЭДТА.

2. Добавьте 100 или 500-кратный молярный избыток ДНК BamHI-фрагмёнтов supF, предварительно проверенных на эффективность лигирования. Для этого проведите самолигирование и последующий анализ геля. По нашему мнению, наиболее удобно получать фрагменты генов supF электрофорезом с последующей электроэлюцией. Важно, чтобы фрагмент был максимально очищен от плазмиды, поскольку даже незначительные количества ее могут проявиться в окончательной библиотеке в виде клонов, гибридизующихся с зондом, несущим плазмиду. Оставьте смесь supF ДНК с геномной ДНК на полчаса.

3. Доведите концентрацию магния до 10 мМ и оставьте смесь еще на 10 мин, чтобы установилось равновесие. Затем добавьте ДНК-лигазу бактериофага Т4 до конечной концентрации 1–2 ед./мкл. Лигируйте 12 ч при 14°С, затем добавьте вторую порцию лигазы и лигируйте еще 12 ч. Осадите циклизовавшуюся ДНК этанолом, добавив 20 мкг дрожжевой тРНК-носителя. Отцентрифугируйте осадок при 23000 об/мин в роторе SW27. Ресуспендируйте осадок в 100 мкл ТЕ и инактивируйте все нелигировавшиеся концы, либо обработав их щелочной фосфатазой, либо добавив фрагмент Клёнова ДНК-полимеразы I. Эта стадия очень важна, так как, если лигирование при низких концентрациях происходит не полностью, свободные фрагменты могут аномально лигироваться с вектором. Экстрагируйте ДНК фенолом, осадите и, растворив, снова обработайте EcoRl.

Популярные статьи:

Осьминоги
ОСЬМИНОГИ (Octopoda), отряд морских моллюсков класса головоногих. Наиболее известен приморскому жителю гигантский осьминог Octopus dofleini, один из самых больших осьминогов планеты. Он является промысловым видом. Длина его мантии (меш ...

Рациональная организация урока
От правильной организации урока, уровня его гигиенической рациональности во многом зависит функциональное состояние школьников в процессе учебной деятельности, возможность длительно поддерживать умственную работоспособность на высоком уро ...

Ботанический сад им. А.В. Фомина. История формирования ботанического сада
Ботанический сад имени академика А.В.Фомина - один из старых ботанических садов на Украине. Он был основан 22 мая 1839 года. Выдающиеся ученые такие как О.С. Рогович, И.Г. Борщов, И.Ф. Шмальгаузен и другие работали в нашем Ботаническом са ...