Основы клонирования, техника клонирования, клонирование ДНК

Страница 1

Основные методы инженерии были разработаны вначале 70-х гг. Суть этих методов - введение в организм нового гена. Такой ген может быть синтезирован заново, а может быть перенесен из другого организма. Если в геном бактерии встроить ген, кодирующий какой-либо белок, бактериальная клетка превращается в живую фабрику по производству этого белка. В качестве примера рассмотрим перенос в клетку и генов, кодирующих инсулин человека и гормон роста человека.

Получить копию любого гена в настоящее время задача совсем нетрудная. В некоторых заведениях для этого требуется всего одна исходная копия. Получение множества идентичных копий называют клонированием. В качестве клонирующего вектора (т.е. переносчика ДНК, которую нужно клонировать) традиционно используют плазмиды или бактериофаги. Плазмиды – это небольшие кольцевые фрагменты ДНК, обнаруженные в некоторых бактериях. Они отделены от основной (хромосомной) ДНК, и могут реплицироваться независимо от нее. Бактериофаги (или, для краткости, фаги)- это вирусы, которые могут вводить свою ДНК в бактериальную клетку, эта ДНК реплицируется. Фрагменты ДНК, которые необходимо клонировать, соединяют либо с плазмидной, либо с фаговой ДНК. Полученная «конструкция», состоящая из ДНК-фрагментов различных организмов, называется рекомбинантной ДНК. Если такую ДНК ввести в бактериальную клетку, то с каждым циклом деления увеличивается и число копий рекомбинантной ДНК. Встроенный в бактериальный геном чужеродный ген может использоваться для получения в промышленных количествах полезного белка, например такого, как инсулин человека, который в норме не производится бактериальной клеткой.

Генную инженерию бактерий можно подразделить на пять этапов.

Этап 1. Выделение копии нужного гена из всех остальных генов организма.

Этап 2. Встраивание нужного гена в вектор.

Этап 3. Использование вектора для введения нужного гена в репициентную клетку.

Этап 4. Отбор клеток, в которые вошла чужеродная ДНК (донорная ДНК).

Этап 5. Клонирование гена

Приведенная выше очередность этапов - самая простая. Однако в некоторых случаях порядок действий может быть иным; например, в вектор может быть встроена и клонирована целая группа генов и лишь затем выделен нужный ген.

Этап 1. Получение копии нужного гена.

Это самая трудная часть процесса. Например, в геноме человека (геном это вся ДНК в клетке) насчитывается около 3млрд. нулеотидов и ≈ 100 000 генов. Типичный ген имеет несколько тысяч пар нуклеотидов в длину, так что даже найти конкрентный ген не так просто. Для получения копии гена используют три метода:

1) С помощью обратной траскриптазы получат копию гена на матрице его мРНК;

2) Синтезируют искусственный ген.

3) Используют метод «дробовика» («shotgun»), вклющающий разрезание ДНК рестрикционными ферментами (рестриктазами)и поиск фрагмента, содержащего нужный ген.

Метод «дробовика» - использование рестрикционных ферментов.

Этот первый метод выделения генов был разработан в конце 1960-х начале 1970-х гг. его появление стало возможным благодаря открытию ферментов, называемых рестрикционными (от англ. Restricting- ограничивающий) эндонуклеазами или рестриктазами. Эти ферменты обнаруженные в бактериях, способны разрезать ДНК, например они разрезают любую вторгающуюся в бактериальную клетку вирусную ДНК, ограничивая таким образом размножение вирусов внутри клетки. Разные виды бактерий продуцируют различные рестрекционные эндонулеазы. Кажда из них разрезает нуклеоновую кислоту (отсюда «нуклеаза») в строго определенных точках («эндо» означает, что фермент разрезает молекулу изнутри, а не атакует ее с концов). Фермент распознает некую последовательность оснований и взаимодействий именно с ней. Точки разрезания называются сайтами рестрикции. К настоящему времени выделено более 2000 рестриктаз, активных в отношении 230 разных последовательностей. Свою собственную ДНК бактерия защищает путем присоединения к определенным основаниям в сайтах рестрикции метильной группы.

Популярные статьи:

Симметрия природы
Начало стройной симметрии заложила физика в теории кри­сталлов, что зафиксировано в работах И. Ф. Гесселя (1796 -1872) в 1830 г., Л. В. Гадолина (1828 - 1892) в 1867г., А. Шенфлиса (1853 - 1928) в 1890 г. Первоначально речь шла о геометри ...

Факторы, подтверждающие теорию эволюции: палеонтология, сравнительная анатомия, эмбриология и др.
Палеонтология. Эта наука занимается изучением ископаемых остатков, т. е. любых сохранившихся в земной коре следов прежде живших организмов. Среди них — целые организмы, твердые скелетные структуры, окаменелости, отпечатки. В XIX в. эти на ...

Назовите ответственные этапы в развитии человека
Индивидуальное развитие человека Рост развития человеческого организма На процессы роста и развития оказывает влияние большое число самых разнообразных эндо - и экзогенных факторов. "Рост" и "развитие" обычно употреб ...