Определение молекулярной массы нативного белка с помощью гидродинамических методов
Страница 1

Мембранные белки » Определение молекулярной массы нативного белка с помощью гидродинамических методов

Применение этих методов для мембранных белков может быть сопряжено с большими трудностями, вызванными связыванием детергента. Чтобы оценить это в полной мере, рассмотрим вначале простой растворимый белок, для которого установлена мол. масса субъединиц с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН и необходимо узнать, чем он является в неденатурированной, активной форме — мономером, димером или олигомером более высокого порядка. Для определения молекулярной массы белков часто используется гель-фильтрация, включающая сравнение со стандартными белками; здесь возникают проблемы, связанные с тем, что все стандартные белки имеют глобулярную форму, а исследуемый белок может быть не глобулярным, а слегка удлиненным. Такой белок с мол. массой 50 000 может элюировать со скоростью, соответствующей мол. мае

се 100 ООО. В связи с этим колонка для гель-фильтрации должна быть прокалибрована в соответствии со значениями радиуса Стокса, т. е. с размерами «эквивалентной гидродинамической сферы», а кроме того, параллельно необходимо использовать какой-либо другой метод. Обычно измеряют скорость седиментации с помощью либо аналитического ультрацентрнфугирования, либо центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Коэффициент седиментации равен

где м — молекулярная масса белка,

v — его парциальный удельный объем, ij — вязкость раствора, б — плотность раствора.

Поскольку е и Ч известны, a Rc можно определить с помощью гель-фильтрации, остаются только две неизвестные величины — v и м. Для водорастворимых белков v можно вычислить исходя из аминокислотного состава или непосредственно измерить либо просто принять равным 0,72—0,75 мл/г. Таким образом, измерив S0, можно найти м.

Рассмотрим теперь ситуацию с мембранным белком. Здесь возникают дополнительные проблемы, поскольку гидродинамическая частица — это белково-детергентный комплекс, поэтому м и v в данном случае являются молекулярной массой и удельным объемом комплекса, Мк и К,. К сожалению, К, нельзя оценить, не зная ничего о составе комплекса. В этом случае для нахождения молекулярной массы белка используют два метода.

1.Прямо измеряют количество связанного детергента на 1 г белка. Для этого используют спектральные методы или радиоактивно меченный детергент, а для выделения комплексов применяют различные методы, например гель-фильтрацию. Установив относительное содержание белка и детергента в комплексе, значение К, получают как средневзвешенное соответствующих величин для чистого белка и чистого детергента. После этого без труда находят м„ а поскольку соотношение между белком и детергентом в комплексе известно, находят молекулярную массу белка.

2.Измеряют S0 в средах с разными значениями плотности раствора д. Такие среды обычно получают, используя смеси НгО и D2O. Из графика зависимости S° от q находят как Л/„ так и vt. При этом предполагается, что К, — это средневзвешенное соответствующих величин для чистого белка и чистого детергента.

ОцеНИВ Квело* и взяв детергент из таблиц, получают молекулярную массу белковой составляющей м,.

Для построения графика зависимости 5° от q проводят аналитическое центрифугирование. Можно проводить центрифугирование и в градиенте плотности сахарозы, используя смеси Н2О и D2O, но анализ результатов в этом случае гораздо сложнее, хотя принципиально не отличается от предыдущего случая.

Альтернативный способ определения молекулярной массы нативной формы мембранного белка состоит в равновесном ультрацентрифугировании. Распределение вещества в состоянии равновесия таково, что наклон графика зависимости логарифма концентрации от г2 равен

где г — расстояние от центра ротора до данной точки в центрифужной пробирке, W — частота вращения.

Если величина У известна или ее легко оценить, как для большинства растворимых белков, эта задача решается достаточно просто. Что касается мембранных белков, то в этом случае определяют на-

Таблица 3. Связывание детергентов с некоторыми мембранными белками

Белок

Na + /К * -АТРаза

Детергент Тритон Х-100

Количество связанного детергента, мг на 1 мг белка

0,28

Ссылки

Са2 + -АТРаза

Тритон Х-100

0,20

Белок полосы 3

Тритон Х-100

0,77

Ацетилхолиновый

Тритон Х-100

0,70

рецептор

Родопсин

Тритон Х-100

1,10

Переносчик

Тритои Х-100

1,5

ADP/ATP

Инсулииовый

Тритон Х-100

0,15; 0,31; 0,54

рецептор

Инсулииовый

Дезоксихолат

0,01; 0,03

рецептор

Цитохром

Тритон Х-100

0,6

с-оксидаза

Цитохром

Лаурилмальтозид

0,55

Страницы: 1 2


Популярные статьи:

Практическое значение
Является вредным животным, наносящим ущерб охотничьему и сельскому хозяйству, охота на него разрешена круглый год. Для сокращения численности волка выделяются ежегодно средства из республиканского и областного бюджетов. По этим программам ...

Классификация бактерий
ВидÞродÞсемействоÞпорядокÞкласс. Сущ. естественная (только создается в настоящее время) и искусственная классификация; используется морфо-физиологический метод: 1) морфологические признаки (размер, форма, окраска…) ...

Смертность, враги, болезни, конкуренты косули
Смертность косули относительно высока. В различных районах неоднократно наблюдалась массовая гибель животных, в связи с неблагоприятными условиями зимовки и усилением действия других факторов. Наибольшую опасность для косуль, особенно зим ...