Определение молекулярной массы нативного белка с помощью гидродинамических методов

Страница 1

Применение этих методов для мембранных белков может быть сопряжено с большими трудностями, вызванными связыванием детергента. Чтобы оценить это в полной мере, рассмотрим вначале простой растворимый белок, для которого установлена мол. масса субъединиц с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН и необходимо узнать, чем он является в неденатурированной, активной форме — мономером, димером или олигомером более высокого порядка. Для определения молекулярной массы белков часто используется гель-фильтрация, включающая сравнение со стандартными белками; здесь возникают проблемы, связанные с тем, что все стандартные белки имеют глобулярную форму, а исследуемый белок может быть не глобулярным, а слегка удлиненным. Такой белок с мол. массой 50 000 может элюировать со скоростью, соответствующей мол. мае

се 100 ООО. В связи с этим колонка для гель-фильтрации должна быть прокалибрована в соответствии со значениями радиуса Стокса, т. е. с размерами «эквивалентной гидродинамической сферы», а кроме того, параллельно необходимо использовать какой-либо другой метод. Обычно измеряют скорость седиментации с помощью либо аналитического ультрацентрнфугирования, либо центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Коэффициент седиментации равен

где м — молекулярная масса белка,

v — его парциальный удельный объем, ij — вязкость раствора, б — плотность раствора.

Поскольку е и Ч известны, a Rc можно определить с помощью гель-фильтрации, остаются только две неизвестные величины — v и м. Для водорастворимых белков v можно вычислить исходя из аминокислотного состава или непосредственно измерить либо просто принять равным 0,72—0,75 мл/г. Таким образом, измерив S0, можно найти м.

Рассмотрим теперь ситуацию с мембранным белком. Здесь возникают дополнительные проблемы, поскольку гидродинамическая частица — это белково-детергентный комплекс, поэтому м и v в данном случае являются молекулярной массой и удельным объемом комплекса, Мк и К,. К сожалению, К, нельзя оценить, не зная ничего о составе комплекса. В этом случае для нахождения молекулярной массы белка используют два метода.

1.Прямо измеряют количество связанного детергента на 1 г белка. Для этого используют спектральные методы или радиоактивно меченный детергент, а для выделения комплексов применяют различные методы, например гель-фильтрацию. Установив относительное содержание белка и детергента в комплексе, значение К, получают как средневзвешенное соответствующих величин для чистого белка и чистого детергента. После этого без труда находят м„ а поскольку соотношение между белком и детергентом в комплексе известно, находят молекулярную массу белка.

2.Измеряют S0 в средах с разными значениями плотности раствора д. Такие среды обычно получают, используя смеси НгО и D2O. Из графика зависимости S° от q находят как Л/„ так и vt. При этом предполагается, что К, — это средневзвешенное соответствующих величин для чистого белка и чистого детергента.

ОцеНИВ Квело* и взяв детергент из таблиц, получают молекулярную массу белковой составляющей м,.

Для построения графика зависимости 5° от q проводят аналитическое центрифугирование. Можно проводить центрифугирование и в градиенте плотности сахарозы, используя смеси Н2О и D2O, но анализ результатов в этом случае гораздо сложнее, хотя принципиально не отличается от предыдущего случая.

Альтернативный способ определения молекулярной массы нативной формы мембранного белка состоит в равновесном ультрацентрифугировании. Распределение вещества в состоянии равновесия таково, что наклон графика зависимости логарифма концентрации от г2 равен

где г — расстояние от центра ротора до данной точки в центрифужной пробирке, W — частота вращения.

Если величина У известна или ее легко оценить, как для большинства растворимых белков, эта задача решается достаточно просто. Что касается мембранных белков, то в этом случае определяют на-

Таблица 3. Связывание детергентов с некоторыми мембранными белками

Популярные статьи:

Вывод
1. Флора однодольных степных сообществ в окрестностях сёл Ясашная Ташла и Тушна насчитывает 3 семейства и 10 видов. 2. наибольшим числом видов представлено семейство злаковые (6 видов), что характерно для степных сообществ. 3. биоморфол ...

Предложения производству
Хотелось бы предложить продолжение мониторинга за селемджинской популяцией сибирской косули на переправах через реки Нора и Орловка, чтобы иметь возможность прогнозировать её состояние. При проведении мониторинга необходимо обеспечение на ...

Взаимодействие естественных наук. Научный метод
Развитие научного метода долгое время было привилегией философии, которая и сейчас продолжает играть определенную роль в разработке методологических проблем. В XX в. методологические средства становятся более дифференцированными и в конкр ...