Электрофорез белков (общие положения)

Страница 2

Вполне возможно, что столкнувшись с такими трудностями экспериментатору придется отказаться от первоначально выбранного буфера и заменить его на другой, с менее подвижными ионами.

Я не собираюсь приводить здесь практические рецепты. Мне только хотелось показать, что выбор буфера для электрофореза дело тонкое, требующее вдумчивой оценки данной конкретной ситуации. Тестостерон ципионат

Теперь обратимся к другой стороне проблемы. До сих пор мы рассматривали только равновесие электрических сил, действующих на белки и сил трения в жидкости. Размер частиц в этом случае может сказываться двояко. С одной стороны будет увеличиваться сила трения в водной среде, но, с другой стороны, может увеличиться и суммарный электрический заряд на поверхности белковой глобулы. Попробуем различие размеров разных белков использовать более определенным образом. Для этого создадим помимо трения о жидкость еще и дополнительное трение — напрямую связанное с размерами мигрирующих молекул белка. Создадим искусственные преграды для миграции в виде пространственной сетки, ячейки которой будут соизмеримы с размерами белков. Эта сетка должна быть образована волокнами, которые надежно смачивает вода, коль скоро мы будем работать в водных растворах. В этом случае буфер будет заполнять ячейки сетки целиком. Хорошо бы, чтобы в нашем распоряжении была возможность выбирать размеры ячеек или пор этой сетки — в зависимости от диапазона размеров белков, которые мы собираемся разделять. Очевидно, что все молекулы белков должны иметь возможность проходить через поры, ни в коем случае не застревать в них. Но проходя, они должны постоянно сталкиваться с образующими поры нитями, что будет тормозить их миграцию в электрическом поле. И чем крупнее белки, тем чаще им придется испытывать эти столкновения, тем «труднее« и медленнее они будут мигрировать. Самые мелкие белки, напротив, будут проходить через поры едва касаясь их нитей. Скорость миграции для белков различной величины, опять-таки, установится постоянной, поскольку статистически постоянным будет эффект столкновения с нитями — он зависит только от соотношения размеров молекул белка и пор. Мы получаем мощное средство разделения белков по их размерам.

Таким образом, выбирая пористость сетки и оценивая результаты разделения белков придется принимать во внимание не только их массу, но и конфигурацию. Мало того, придется учитывать и жесткость (плотность упаковки) белковой молекулы. Рыхлые глобулярные (и особенно фибриллярные) белки могут деформироваться при взаимодействии с сеткой и тем самым облегчать себе миграцию между ее нитями.

Но что же это за сетка, которую мы хотим создать? И как это сделать? Скорее всего это будет гель, подобный пищевому желе, которое получают очень небольшой добавкой желатина к фруктовому соку, или нечто похожее на уже знакомый нам агар. Прежде, чем поговорить об этом геле подробнее, отметим, что благодаря силам смачивания жидкость из геля с достаточно мелкими порами не будет вытекать, даже если она составит 95% его массы. А это значит, что заполнив нашу трубочку гелем, мы можем поставить ее вертикально, как это показано на рис. 36. Кстати сказать, так и выглядели первые приборчики для электрофореза.

Рис. 36

Вертикальное расположение трубочки с гелем сразу обнаруживает одно существенное преимущество. Теперь препарат исходной смеси белков можно наносить тонким ровным слоем на верхнюю поверхность геля. В результате чего и разделяющиеся в ходе миграции в электрическом поле белки будут двигаться вниз в виде тонких дисков. (Каждый со своей скоростью, постепенно располагаясь на всей длине трубочки.)

Разумеется, буферы верхнего и нижнего резервуаров должны смачивать оба торца геля в трубочке. Поэтому гель не должен заполнять трубочку до самого верху, оставляя место для нанесения препарата. В исходную белковую смесь (тоже растворенную в буфере) можно добавить 5-10% сахарозы или глицерина. В таком виде ее можно вносить в трубочку пипеткой с оттянутым полиэтиленовым наконечником, осторожно подслаивая под буфер, находящийся в трубочке.

В ходе электрофореза зоны растворенных белков остаются невидимыми. Для наблюдения за процессом разделения в исходный препарат добавляют 0,01% красителя, молекулы которого несут на себе электрический заряд того же знака, что и фракционируемые белки, но не взаимодействуют с ними. Краситель в электрическом поле перемещается вдоль трубочки в виде окрашенной полоски. Его подбирают таким образом, чтобы скорость его миграции была немного больше, чем скорость наиболее подвижных молекул белка. Когда окрашенная полоска доходит до конца трубочки электрофорез прекращают. В качестве отрицательно заряженного красителя широко используют «Бромфеноловый синий». Для электрофореза щелочных, положительно заряженных белков — «Метиловый зеленый» или «Пиронин».

Популярные статьи:

Клонирование и скрининг
На этой стадии обработанные кольцевые молекулы геномной ДНК уже можно лигировать и производить селекцию сцепленных фрагментов. Для селекции геномные фрагменты встраивают в фаговый вектор, несущий амбермутации по крайней мере двух генов бе ...

Семейство Сусаковые (Butomaceae)
Почти на всей территории СССР по берегам водоемов обычно среди другого болотного высокотравья встречается сусак зонтичный (Butomus umbellatus) единственный представитель семейства сусаковых. Его собранные в крупные зонтиковидные соцветия ...

Энергетический обмен микробов. Способы получения энергии – брожение, дыхание. Типы дыхания бактерий
Жизненные функции микроорганизмов: питание, дыхание, рост и размножение — изучает физиология. В основе физиологических функций лежит непрерывный обмен веществ (метаболизм). Сущность обмена веществ составляют два противоположных, но взаимо ...