Электрофорез белков (общие положения)

Страница 2

Вполне возможно, что столкнувшись с такими трудностями экспериментатору придется отказаться от первоначально выбранного буфера и заменить его на другой, с менее подвижными ионами.

Я не собираюсь приводить здесь практические рецепты. Мне только хотелось показать, что выбор буфера для электрофореза дело тонкое, требующее вдумчивой оценки данной конкретной ситуации.

Теперь обратимся к другой стороне проблемы. До сих пор мы рассматривали только равновесие электрических сил, действующих на белки и сил трения в жидкости. Размер частиц в этом случае может сказываться двояко. С одной стороны будет увеличиваться сила трения в водной среде, но, с другой стороны, может увеличиться и суммарный электрический заряд на поверхности белковой глобулы. Попробуем различие размеров разных белков использовать более определенным образом. Для этого создадим помимо трения о жидкость еще и дополнительное трение — напрямую связанное с размерами мигрирующих молекул белка. Создадим искусственные преграды для миграции в виде пространственной сетки, ячейки которой будут соизмеримы с размерами белков. Эта сетка должна быть образована волокнами, которые надежно смачивает вода, коль скоро мы будем работать в водных растворах. В этом случае буфер будет заполнять ячейки сетки целиком. Хорошо бы, чтобы в нашем распоряжении была возможность выбирать размеры ячеек или пор этой сетки — в зависимости от диапазона размеров белков, которые мы собираемся разделять. Очевидно, что все молекулы белков должны иметь возможность проходить через поры, ни в коем случае не застревать в них. Но проходя, они должны постоянно сталкиваться с образующими поры нитями, что будет тормозить их миграцию в электрическом поле. И чем крупнее белки, тем чаще им придется испытывать эти столкновения, тем «труднее« и медленнее они будут мигрировать. Самые мелкие белки, напротив, будут проходить через поры едва касаясь их нитей. Скорость миграции для белков различной величины, опять-таки, установится постоянной, поскольку статистически постоянным будет эффект столкновения с нитями — он зависит только от соотношения размеров молекул белка и пор. Мы получаем мощное средство разделения белков по их размерам.

Таким образом, выбирая пористость сетки и оценивая результаты разделения белков придется принимать во внимание не только их массу, но и конфигурацию. Мало того, придется учитывать и жесткость (плотность упаковки) белковой молекулы. Рыхлые глобулярные (и особенно фибриллярные) белки могут деформироваться при взаимодействии с сеткой и тем самым облегчать себе миграцию между ее нитями.

Но что же это за сетка, которую мы хотим создать? И как это сделать? Скорее всего это будет гель, подобный пищевому желе, которое получают очень небольшой добавкой желатина к фруктовому соку, или нечто похожее на уже знакомый нам агар. Прежде, чем поговорить об этом геле подробнее, отметим, что благодаря силам смачивания жидкость из геля с достаточно мелкими порами не будет вытекать, даже если она составит 95% его массы. А это значит, что заполнив нашу трубочку гелем, мы можем поставить ее вертикально, как это показано на рис. 36. Кстати сказать, так и выглядели первые приборчики для электрофореза.

Рис. 36

Вертикальное расположение трубочки с гелем сразу обнаруживает одно существенное преимущество. Теперь препарат исходной смеси белков можно наносить тонким ровным слоем на верхнюю поверхность геля. В результате чего и разделяющиеся в ходе миграции в электрическом поле белки будут двигаться вниз в виде тонких дисков. (Каждый со своей скоростью, постепенно располагаясь на всей длине трубочки.)

Разумеется, буферы верхнего и нижнего резервуаров должны смачивать оба торца геля в трубочке. Поэтому гель не должен заполнять трубочку до самого верху, оставляя место для нанесения препарата. В исходную белковую смесь (тоже растворенную в буфере) можно добавить 5-10% сахарозы или глицерина. В таком виде ее можно вносить в трубочку пипеткой с оттянутым полиэтиленовым наконечником, осторожно подслаивая под буфер, находящийся в трубочке.

В ходе электрофореза зоны растворенных белков остаются невидимыми. Для наблюдения за процессом разделения в исходный препарат добавляют 0,01% красителя, молекулы которого несут на себе электрический заряд того же знака, что и фракционируемые белки, но не взаимодействуют с ними. Краситель в электрическом поле перемещается вдоль трубочки в виде окрашенной полоски. Его подбирают таким образом, чтобы скорость его миграции была немного больше, чем скорость наиболее подвижных молекул белка. Когда окрашенная полоска доходит до конца трубочки электрофорез прекращают. В качестве отрицательно заряженного красителя широко используют «Бромфеноловый синий». Для электрофореза щелочных, положительно заряженных белков — «Метиловый зеленый» или «Пиронин».

Популярные статьи:

Корпускулярно – волновой дуализм. Его сущность. Необычные свойства микрообъектов. Гипотеза де Бройля
В природе микрообъекты имеют необычные свойства, которые проявляются посредством экспериментов. Так учеными было установлено, что микрообъекты в одних опытах обнаруживают себя как материальные частицы, или корпускулы, в других — как волны ...

Металлсвязывающая способность флавоноидов
Флавоноиды также могут действовать как хелаторы ионов металла с радикалами О- и ОН*, так и на стадии продолжения цепи, выступая донорами атомов водорода для перекисных радикалов. Многие флавоноиды действуют как хелаторы ионов металлов пер ...

Проба Мартинэ
Измеряется величина артериального давления и подсчитывается частота пульса в состоянии покоя. Затем обследуемый выполняет 20 низких (глубоких) приседаний (ноги на ширине плеч, руки вытянуты вперёд) в течение 30 секунд. Непосредственно пос ...