Клонирование и скрининг

На этой стадии обработанные кольцевые молекулы геномной ДНК уже можно лигировать и производить селекцию сцепленных фрагментов. Для селекции геномные фрагменты встраивают в фаговый вектор, несущий амбермутации по крайней мере двух генов белковой оболочки, упаковывают фаговую ДНК in vitro и инфицируют клетки бактерии-хозяина, лишенные функции supF. Формировать бляшки на таком газоне могут только те фаговые частицы, геномы которых содержат собственные supF-гены.

Теоретически подходит любой фаговый вектор, несущий амбер-мутации и клонирующий сайт. Желательно, конечно, чтобы этот вектор обеспечивал максимальную клонирующую емкость. Идеальной можно считать ситуацию, когда кольцевые геномные фрагменты расщеплялись бы лишь частично мелкощепящим ферментом, а затем лигировались в вектор большой емкости, чтобы не было дискриминации фрагментов, обусловленной расположением сайтов рестрикции. Однако обязательные потери, происходящие при частичном расщеплении, оказываются препятствием на пути создания полной библиотеки. Имеющиеся у нас в настоящее время стандартные геномные библиотеки для «прыжков по хромосоме» были получены в результате полного расщепления кольцевых геномных фрагментов рестриктазой EcoRl. Можно использовать и другие ферменты, для которых имеются амбермутантные фаговые клонирующие векторы.

Популярные статьи:

Хромосомы и их наследственность. ДНК - основной материальный носитель наследственности
Хромосомы. ДНК защищена от внешних воздействий «упаковкой» из белков и организована в хромосомы, находящиеся в ядре клетки. В хромосоме регулируется активность генов, их восстановление при радиационном, химическом или ином типе повреждени ...

Жароустойчивость
Жароустойчивость зависит от продолжительности воздействия тепла, т. е. подчиняется закону дозы: более умеренная жара при большой продолжительности оказывает такое же повреждающее действие, как и кратковременная сильная жара. Поэтому услов ...

Изучение перекисного окисления липидов в присутствии дигидрокверцетина
Влияние на процесс образования продуктов ПОЛ, таких как малоновый диальдегид (МДА) и монокарбонильные соединения, в присутствие флавоноида определялось по реакции образующихся альдегидов с тиобарбитуровой кислотой. В пробирки, содержащие ...