Клонирование и скрининг

На этой стадии обработанные кольцевые молекулы геномной ДНК уже можно лигировать и производить селекцию сцепленных фрагментов. Для селекции геномные фрагменты встраивают в фаговый вектор, несущий амбермутации по крайней мере двух генов белковой оболочки, упаковывают фаговую ДНК in vitro и инфицируют клетки бактерии-хозяина, лишенные функции supF. Формировать бляшки на таком газоне могут только те фаговые частицы, геномы которых содержат собственные supF-гены.

Теоретически подходит любой фаговый вектор, несущий амбер-мутации и клонирующий сайт. Желательно, конечно, чтобы этот вектор обеспечивал максимальную клонирующую емкость. Идеальной можно считать ситуацию, когда кольцевые геномные фрагменты расщеплялись бы лишь частично мелкощепящим ферментом, а затем лигировались в вектор большой емкости, чтобы не было дискриминации фрагментов, обусловленной расположением сайтов рестрикции. Однако обязательные потери, происходящие при частичном расщеплении, оказываются препятствием на пути создания полной библиотеки. Имеющиеся у нас в настоящее время стандартные геномные библиотеки для «прыжков по хромосоме» были получены в результате полного расщепления кольцевых геномных фрагментов рестриктазой EcoRl. Можно использовать и другие ферменты, для которых имеются амбермутантные фаговые клонирующие векторы.

Популярные статьи:

Подсчет клеток на фиксированных окрашенных мазках (метод Виноградского-Брида)
Метод широко используется для определения численности микроорганизмов в различных естественных субстратах – почве, загрязненных водах, молоке и т.п. [13]. Хорошо обезжиренное предметное стекло помещают на миллиметровую бумагу, на которой ...

Подтипы и классы хордовых
К типу хордовых относятся три подтипа–Бесчерепные, Личиночно – хордовые и Позвоночные. Хордовые имеют на ранних стадиях развития внутренний скелет–хорду. Хордовые занимают основные среды жизни: водную, наземно-воздушную и почвенную. Это ...

Сколько существует больших рас?
Формирование больших рас Примерно 100 тыс. лет назад на континенте Азия с прилегающими областями Африки и Европы обозначились две основные расовые группы: юго-западная и северо-восточная. Их разделяли горные цепи Гималаев, Гиндукуша и хр ...