Клонирование и скрининг

На этой стадии обработанные кольцевые молекулы геномной ДНК уже можно лигировать и производить селекцию сцепленных фрагментов. Для селекции геномные фрагменты встраивают в фаговый вектор, несущий амбермутации по крайней мере двух генов белковой оболочки, упаковывают фаговую ДНК in vitro и инфицируют клетки бактерии-хозяина, лишенные функции supF. Формировать бляшки на таком газоне могут только те фаговые частицы, геномы которых содержат собственные supF-гены.

Теоретически подходит любой фаговый вектор, несущий амбер-мутации и клонирующий сайт. Желательно, конечно, чтобы этот вектор обеспечивал максимальную клонирующую емкость. Идеальной можно считать ситуацию, когда кольцевые геномные фрагменты расщеплялись бы лишь частично мелкощепящим ферментом, а затем лигировались в вектор большой емкости, чтобы не было дискриминации фрагментов, обусловленной расположением сайтов рестрикции. Однако обязательные потери, происходящие при частичном расщеплении, оказываются препятствием на пути создания полной библиотеки. Имеющиеся у нас в настоящее время стандартные геномные библиотеки для «прыжков по хромосоме» были получены в результате полного расщепления кольцевых геномных фрагментов рестриктазой EcoRl. Можно использовать и другие ферменты, для которых имеются амбермутантные фаговые клонирующие векторы.

Популярные статьи:

Уход за кошкой
Здоровье вашей кошки в большей степени зависит от регулярного сбалансированного питания. Взрослую кошку следует кормить два раза в день; скорее всего, она сама напомнит о том, что пора обедать! Подрастающих котят надо кормить часто, но п ...

Алкоголь и его воздействие на организм
Основным действующим началом опьянения любого напитка являлся алкоголь этиловый, или винный, спирт. Принятый внутрь он через 5 -10 минут всасывается в кровь и разноситься по всему организму. Алкоголь - яд для любой живой клетки. Проникну ...

Почвы нечерноземной зоны России, опишите свойства дерново-подзолистых почв и мероприятия по улучшению их плодородия
Примерно около ста лет тому назад для большинства освоенных земель мощность пахотного слоя была около 10-14 сантиметров. После внедрения более совершенного плуга она достигла большей величины. В настоящее время еще не везде установлена оп ...