Клонирование и скрининг

На этой стадии обработанные кольцевые молекулы геномной ДНК уже можно лигировать и производить селекцию сцепленных фрагментов. Для селекции геномные фрагменты встраивают в фаговый вектор, несущий амбермутации по крайней мере двух генов белковой оболочки, упаковывают фаговую ДНК in vitro и инфицируют клетки бактерии-хозяина, лишенные функции supF. Формировать бляшки на таком газоне могут только те фаговые частицы, геномы которых содержат собственные supF-гены.

Теоретически подходит любой фаговый вектор, несущий амбер-мутации и клонирующий сайт. Желательно, конечно, чтобы этот вектор обеспечивал максимальную клонирующую емкость. Идеальной можно считать ситуацию, когда кольцевые геномные фрагменты расщеплялись бы лишь частично мелкощепящим ферментом, а затем лигировались в вектор большой емкости, чтобы не было дискриминации фрагментов, обусловленной расположением сайтов рестрикции. Однако обязательные потери, происходящие при частичном расщеплении, оказываются препятствием на пути создания полной библиотеки. Имеющиеся у нас в настоящее время стандартные геномные библиотеки для «прыжков по хромосоме» были получены в результате полного расщепления кольцевых геномных фрагментов рестриктазой EcoRl. Можно использовать и другие ферменты, для которых имеются амбермутантные фаговые клонирующие векторы.

Популярные статьи:

Кормовые севообороты, условия их применения
Классификация севооборотов. Колхозы и совхозы имеют по нескольку тысяч гектаров пахотных земель и возделывают десятки различных сельскохозяйственных культур. Возникает необходимость в такой организации полевого хозяйства, при которой каж ...

Итоговые замечания и выводы
При обсуждении роли различных форм изменчивости и значения наследственности почти не затрагивалась дарвиновская теория борьбы за существование и естественного отбора, т. е. была предпринята попытка обсудить вопрос об эволюционном значении ...

Теоретическая проблема исследования
Начало активного развития дерматологии, которое пришлось на середину XVI века, было связано с общим научным и техническим прогрессом. Еще в древности были предприняты попытки описания кожи, слизистых оболочек, о чем свидетельствуют дошедш ...