Клонирование и скрининг

На этой стадии обработанные кольцевые молекулы геномной ДНК уже можно лигировать и производить селекцию сцепленных фрагментов. Для селекции геномные фрагменты встраивают в фаговый вектор, несущий амбермутации по крайней мере двух генов белковой оболочки, упаковывают фаговую ДНК in vitro и инфицируют клетки бактерии-хозяина, лишенные функции supF. Формировать бляшки на таком газоне могут только те фаговые частицы, геномы которых содержат собственные supF-гены.

Теоретически подходит любой фаговый вектор, несущий амбер-мутации и клонирующий сайт. Желательно, конечно, чтобы этот вектор обеспечивал максимальную клонирующую емкость. Идеальной можно считать ситуацию, когда кольцевые геномные фрагменты расщеплялись бы лишь частично мелкощепящим ферментом, а затем лигировались в вектор большой емкости, чтобы не было дискриминации фрагментов, обусловленной расположением сайтов рестрикции. Однако обязательные потери, происходящие при частичном расщеплении, оказываются препятствием на пути создания полной библиотеки. Имеющиеся у нас в настоящее время стандартные геномные библиотеки для «прыжков по хромосоме» были получены в результате полного расщепления кольцевых геномных фрагментов рестриктазой EcoRl. Можно использовать и другие ферменты, для которых имеются амбермутантные фаговые клонирующие векторы.

Популярные статьи:

Человек, здоровье и работоспособность
Говоря о работоспособности, выделяют общую (потенциальную, максимально возможную работоспособность при мобилизации всех резервов организма) и фактическую работоспособность, уровень которой всегда ниже. Фактическая работоспособность зависи ...

Орган вкуса. Филогенез. Проводящий путь
Орган вкуса представляют вкусовые почки, имеющие вид эллипсовидных образований, длиной приблизительно 80, а шириной 40 мкм. У человека вкусовые почки, их рецепторный аппарат находятся главным образом на боковых стенках желобовид-ных сосоч ...

Репликативный синтез ДНК и пролиферация нервных клеток
Формирование нейронольных популяций в головном мозге крыс и мышей в основном завершается к моменту рождения. Исключение составляют популяции зернистых нейронов обонятельных луковиц, зубчатой фасции гиппокампа и коры мозжечка, формирование ...