Экспериментальная часть

В работе использовали α-химотрипсин, «Fluka, Biochemika» (Германия); поли-L-лизин (PLL)(150-300 кДа), «Fluka», США; альгинат натрия средней вязкости (Alg), «Sigma» (Германия); трипсин (ТР) "Sigma" (Германия); N- Бензоил-L-тирозин (ВТЕЕ), "Sigma" (Германия); этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), «Sigma» (Германия), ТРИС-буфер, "Sigma" (Германия); хлорид натрия, соляная кислота, гидроксид натрия.

1. Получение микрочастиц карбоната кальция

Эквивалентный объем (15 мл) 0,33 N водного раствора Na2CO3 быстро приливали при перемешивании (400-900 об/мин) к 0,33 N водному раствору CaCl2 После перемешивания в течение 60 сек, суспензию образовавшихся частиц оставляли на 5-7 минут до полной кристаллизации карбоната кальция. Далее осадок CaCO3 промывали 50 мл воды и фильтровали. Отмывку повторяли 3 раза. Последний раз микрочастицы промывали спиртом или ацетоном, после чего фильтр помещали под нагревательную лампу и сушили 1,5 час при 50-60 оС. Сухие микрочастицы CaCO3 хранили в закупоренной емкости при комнатной температуре.

2. Включение ХТР в

CaCO

3

микрочастицы методом адсорбции в порах

50-100 мг CaCO3 микрочастиц диаметром 3-5 микрон суспендировали в 1 мл раствора фермента (5-10 мг/мл) в воде. После инкубации на шейкере или качалке в течение 2 часов, микрочастицы осаждали центрифугированием (1000 об/мин, 5 мин) и отделяли супернатант. Далее частицы оставляли на 10 часов в холодильнике, центрифугировали (1000 об/мин, 5 мин), отбирали супернатант. После этого, частицы дважды промывали водой (1мл), используя центрифугирование (1000 об/мин, 5 мин)/ресупендирование.

3. Получение полиэлектролитных микрокапсул

Капсулы получали на CaCO3 частицах с диаметром 3-5 мкм последовательной адсорбцией Alg (2 мг/мл) и PLL (2 мг/мл) в 0,02 N NaCl. Нанесение каждого слоя полиэлектролитов проводили в течение 15 минут, затем частицы центрифугировали и дважды промывали в 0,02 N NaCl. При агрегации частиц между собой в процессе адсорбции ПЭ, суспензию микрочастиц подвергали обработке ультразвуком (максимальная мощность) в течение 1-3 сек. После нанесения 3-ех слоев Alg и 3–ех слоев PLL, CaCO3- частицы растворяли 0,2М раствором ЭДТА, рН 7,0. После полного растворение карбонатной матрицы, микросферы промывали в воде 3 раза (время инкубации 3-5 минут) и хранили в виде суспензии при 4 оС.

4. Определение содержания белка в микрочастицах и растворах

Определения концентрации белка в растворах проводили спектрофотометрически. Для этого в кювету на 1,5 мл вводили 1 мл раствора белка и измеряли оптическую плотность при 280 нм. Исследуемые растворы были разбавлены, с учетом коэффициента экстинкции для каждого белка, таким образом, чтобы значение оптической плотности не превышало 2. Калибровочную кривую строили с использованием того же белка, который использовали для получения микрочастиц. Эффективность включения (иммобилизации) белка определяли как отношение оптической плотности в исходном растворе (Dисх) к значению в супернатанте после сорбции(Dсорб).

5. Измерение протеолитической активности ХТР

Для изучения протеолитической активности иммобилизованного ХТР в водной среде (0,08 М ТРИС-буфер, рН 7,8, содержащий 0,1М CaCl2), использовали следующую методику. 40 мкл раствора ХТР или суспензии микросфер с ХТР добавляли в кювету на 1,5 мл, содержащую 0,15 мл 0,08 М ТРИС-буфера, рН 7,8 и 0,14 мл 0,00107 М BTEE в 50% растворе метанола (63 мл абсолютного метанола в 50 мл воды). Прирост оптической плотности регистрировали спектрофотометрически при длине волны 256 нм в течение 5 минут. При этом каждую минуту кювету встряхивали, чтобы избежать осаждения микросфер с включенным белком. Таким образом, прирост оптической плотности был обусловлен накоплением продукта ферментативного гидролиза.


Популярные статьи:

Иммунитет - надежная защита организма.
Ежедневно, ежеминутно в любом организме на страже здоровья человека стоит целая армия клеток и механизмов, которая способна отразить любую инфекционную агрессию. Есть и милиция, готовая в случае необходимости подавить внутреннюю агрессию. ...

Трудовая теория антропогенеза Ф. Энгельса. Факторы и критерии гоминизации
Гоминизация (от лат. "Ното"—человек)—процесс очеловечения: обезьяны—от появления первых специфически человеческих особенностей до возникновения вида человека разумного (Н. sapiens). Это комплексный феномен, включающий развитие п ...

Распространение современного человека
В Африке были найдены более древние ископаемые остатки, чем на каком-либо из других континентов. Так, в Южной Эфиопии нашли Омо-I – неполный череп со многими современными признаками, возраст которого, вероятно, более 60 тысяч лет. В устье ...