Четвертичная структура и химическое сшивание

Страница 1

Многие мембранные ферменты представляют собой комплексы, состоящие из нескольких субъединиц. В качестве примера можно привести Н + -АТРазу, Na + /К +-АТРазу, митохондриальные комплексы электронного транспорта и фотосинтетические реакционные центры. Некоторые интегральные мембранные белки прочно связаны с растворимыми белками с помощью нековалентных взаимодействий. В Е. coli Fo-компонент, содержащий по данным электрофореза в ПААГ-ДСН три типа субъединиц, образует протонный канал, a Fi, состоящий из пяти типов субъединиц, содержит активный центр, участвующий в гидролизе АТР. Для таких белков очень важно определить характер субъединиц, стехиометрию комплекса и ближайшие взаимодействия его компонентов. Это весьма непростая задача даже тогда, когда белковый комплекс уже изолирован. Возникающие здесь проблемы по существу не отличаются от таковых для растворимых белковых комплексов, но имеются и свои дополнительные сложности.

Прежде всего следует иметь в виду, что взаимодействие между субъеднницами очень сильно зависит от типа липидов и детергентов, с которыми связаны белки. Например, сукцинатде-гидрогеназа Е. coli при солюбилизации ее с помощью луброла РХ представляется состоящей из четырех субъединиц, а при солюбилизации большинством других детергентов, в том числе тритоном Х-100, — только из двух. Известно, что оперон sdh кодирует все четыре полипептида, а форма из двух субъединиц имеет аномальный спектр ЭПР. Таким образом, ясно, что in vivo фермент состоит из четырех субъединиц. Однако сукцинатдегидрогеназной активностью обладают обе формы, поэтому используемые биохимические критерии важны для заключения, была ли солюбилизирована правильная форма.

Еще одна проблема связана с тем, что в бислое мембранные белки могут образовывать комплексы из-за высокой их локальной концентрации. При солюбилизации же независимо от используемого детергента может произойти разбавление мембранных белков и их разъединение. По закону действующих масс это приведет к диссоциации комплексов, в которых взаимодействие между компонентами не очень сильное. Часто бывает трудно определить, какой комплекс образуется in situ, а какой — прн солюбилизации и очистке. Подобные проблемы возникают при исследовании многих сложных систем, например системы /3-адренергетический рецептор—адеиилатци-клаза, цепи электронного транспорта у митохондрий, системы мик-Росомных цитохромов Р450 и b$.

Для изучения стехиометрии субъединиц и их ассоциации в очищенном комплексе используется всего несколько методов: 1) химичес кое сшивание; 2) количественный анализ N-концевых аминокислот; 3) определение отношения массы субъединиц в ДСН-полиакриламидных гелях путем определения интенсивности окрашивания, с помощью радиоавтографии или иммуноблоттинга. Каждый метод имеет свои ограничения, но все они использовались на практике. Например, стехиометрию пяти субъединиц никотинового ацетил-холииового рецептора определяли с помощью количественного анализа N-коицевых аминокислот, а трех субъедиииц Fo-компоиента Н + -АТРазы Е. coli — с помощью разделения в ДСН-полиакриламидных гелях. Заметим, что кумасси бриллиантовый синий, обычно используемый для окрашивания белков после разделения в ПААГ-ДСН, связывается предпочтительнее с белками, содержащими основные аминокислотные остатки, и существуют примеры сильно неполярных внутренних мембранных белков, которые лишь едва окрашиваются.

Популярные статьи:

Эволюционная теория: драма в биологии
Эволюционная идея имеет очень древнюю историю: в разной форме мысли о последовательном появлении на Земле живых организмов с постепенно усложняющейся их организацией содержатся и в Книге Бытия, и в "Ригведе", и в произведениях ф ...

Активность нервов и исчезновение синапсов
Физиологические эксперименты показывают, что активность нейронов играет определенную роль в исчезновении синапсов, влияя как на интенсивность, так и на и результат конкуренции между терминалями аксонов. Стимулирование мышцы через нерв при ...

Развитие сердца
Вся кровеносная и вся лимфатическая системы — производные мезодермы. В ходе гаструляции происходит распространение мезодермального пласта клеток между экто- и энтодермой. На стадии нейрулы разрастание спинного и спинно-бокового участков ...